許向陽，周博巖，劉文紅，閆成革，趙婷婷，李景富，姜景彬，張 賀，楊歡歡，孫旭穎

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄是一種風(fēng)味獨特的蔬菜，營養(yǎng)價值高。干旱是限制番茄生長發(fā)育主要因素之一，干旱導(dǎo)致番茄水分虧缺，影響番茄產(chǎn)量[1]。脫落酸不僅調(diào)控植物生長發(fā)育，還參與植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)。植物中脫落酸含量變化調(diào)控植物對干旱環(huán)境響應(yīng)機制。干旱脅迫下，植物體內(nèi)含水量降低，脫落酸含量增加，促使植物葉片氣孔關(guān)閉，減少蒸發(fā)失水。植物細(xì)胞內(nèi)通過代謝產(chǎn)生脯氨酸、多糖等物質(zhì)，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)水分平衡，并調(diào)控抗旱基因表達(dá)，協(xié)同抵抗干旱脅迫對植物組織的傷害[2]。干旱條件下，植物葉片中過氧化氫積累，在抗氧化酶作用下形成一種信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生更多抗氧化酶，通過降低丙二醛和過氧化氫含量，維持植物體內(nèi)含水量穩(wěn)定，提高植物耐旱性[3]。目前，已有許多關(guān)于抗旱基因在植物中的研究。丁安明等將NtabEXPA12 基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)NtabEXPA12 基因與煙草葉片生長發(fā)育相關(guān)，還可提高煙草抗旱性[4]。王猛等將PspA基因轉(zhuǎn)入擬南芥使其過量表達(dá)，在干旱處理條件下，轉(zhuǎn)PspA基因擬南芥生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型植株[5]。陳彬杉等使用農(nóng)桿菌侵染煙草葉片方法，將IbCAF1 基因轉(zhuǎn)入煙草植株[6]。通過與野生型對照煙草表型對比，IbCAF1 基因煙草植株耐旱性增強，IbCAF1 基因表達(dá)增強煙草抗旱能力。

PIN蛋白家族是植物生長素極性運輸主要成員之一，主要在植株激素運輸方向發(fā)揮重要作用。PIN蛋白產(chǎn)生受植物體內(nèi)多種信號影響，其中包含植物細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄、翻譯反應(yīng)，響應(yīng)植物對內(nèi)源信號和外源信號傳導(dǎo)。在植物中，生長素運輸均勻分布在細(xì)胞一側(cè)，PIN蛋白在細(xì)胞中極性分布與生長素運輸一致[7]。PIN 蛋白家族具有細(xì)胞特異性和組織特異性特點，不同PIN 家族成員在植物不同部分表達(dá)，且PIN 蛋白家族功能隨極性位置改變而改變，其中PIN基因亞細(xì)胞定位具有動態(tài)變化特點，受植物自身生長和逆境環(huán)境影響[8]。目前，植物中依賴于PIN極性生長素運輸信息主要來自于對擬南芥中PIN基因家族的廣泛研究。在擬南芥中，PIN 家族由8 個成員組成，分為兩組。第一組包括AtPIN1-AtPIN4、AtPIN6和AtPIN7，具有相對較長的中央親水環(huán)，其序列相似性較高，該蛋白質(zhì)主要負(fù)責(zé)生長素向細(xì)胞外運輸，在細(xì)胞膜上分布不均，對植株生長發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。另一組包括AtPIN5 和AtPIN8，這兩個基因缺少中心環(huán)域，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生長素通訊[9]。此外，PIN基因在其他作物中已有相關(guān)鑒定，與植物細(xì)胞形態(tài)變化和非生物脅迫反應(yīng)關(guān)系密切。張春利通過生物信息學(xué)方法鑒定出番茄PIN 蛋白家族含10 個PIN基因，且發(fā)現(xiàn)SL?PIN1 基因表達(dá)下調(diào)可降低番茄耐旱性[10]。鮑亞寧使用VIGS技術(shù)在亞麻中對LusPIN5a基因沉默，發(fā)現(xiàn)LusPIN5a基因沉默影響亞麻木質(zhì)部細(xì)胞形態(tài)和排列，韌皮部纖維細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化[11]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene si?lencing，VIGS）技術(shù)是依賴于RNA干擾快速降解靶標(biāo)基因分析其功能的一種技術(shù)，與其他技術(shù)相比，VIGS 技術(shù)具有操作簡單、見效快、時間短、高通量、無需轉(zhuǎn)基因等特點[12]。盡管以病毒為載體的VIGS 技術(shù)已在許多植物基因功能驗證中發(fā)揮重要作用，但VIGS技術(shù)仍存在許多缺點。首先VIGS技術(shù)在一些植物中無合適載體，無法構(gòu)建病毒載體侵染植物，其次在侵染植物時，沉默效率過低也是問題之一[13]。植物體內(nèi)八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase gene，PDS）是類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶，當(dāng)PDS 表達(dá)受抑制時，類胡蘿卜素含量顯著降低，植物葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，可用PDS 基因作為指示基因，檢測侵染植物基因是否具有沉默趨勢。目前為止，VIGS 技術(shù)已在許多植物領(lǐng)域中有研究，Akram 通過使用VIGS 技術(shù)將陸地棉苗期GI基因沉默，創(chuàng)造得到耐鹽堿轉(zhuǎn)基因棉花材料，為進(jìn)一步研究GI基因棉花抗逆功能提供理論依據(jù)[14]。范亞鵬使用VIGS 技術(shù)沉默GhZAT12 基因，研究結(jié)果顯示GhZAT12 基因調(diào)控APX基因表達(dá)，影響植物體內(nèi)活性氧變化[15]。吳潔等使用不同載體對棉花基因沉默得出，TRV 體系主要適用于瞬時沉默，用于驗證棉花抗逆方面研究，CLCrV誘導(dǎo)的沉默體系適用于長期沉默，用于棉花基因生長發(fā)育方面驗證[16]。VIGS 技術(shù)在植物生長發(fā)育和抗逆中研究廣泛，因此，利用VIGS 技術(shù)開展植物功能驗證等相關(guān)研究意義重大。

前期研究發(fā)現(xiàn)，SLPIN6 基因在番茄植株干旱處理下上調(diào)表達(dá)，為進(jìn)一步明確該基因抗旱調(diào)節(jié)功能，對野生型植株、空載植株和SLPIN6 基因沉默植株開展模擬干旱處理，通過觀察表型差異和測定生理指標(biāo)，探討SLPIN6 基因?qū)Ψ芽购敌缘挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院番茄研究所提供的番茄品種Moneymaker 作為試驗材料，所有材料統(tǒng)一定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站6號溫室。田間管理參照番茄自然生長條件下光照（12 h）、濕度（50%～58%）、溫度（22～25 ℃）等條件統(tǒng)一管理。定植后18 d，選取長勢健壯、無病蟲害番茄品種作為野生型對照植株（CK）和侵染植株。

1.2 方法

1.2.1 基因片段擴增及VIGS載體構(gòu)建

番茄葉片RNA 提取采用Trizol 法[17]，提取后RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（由北京擎科生物科技有限公司提供）操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在SGN 數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net）中檢索SLPIN6 基因序列，根據(jù)引物特異性設(shè)計原則，利用Prime 5.0 軟件設(shè)計PCR所需SLPIN6基因引物，如表1所示。

表1 SLPIN6基因沉默引物Table 1 SLPIN6 gene silencing primer

選用TRV2 質(zhì)粒作為目的基因載體，從TRV2菌液中提取TRV2 質(zhì)粒后。選用EcoR I 和BamH I兩種酶對TRV2 質(zhì)粒與PCR 擴增后SLPIN6 基因作雙酶切處理，酶切后TRV2 質(zhì)粒與SLPIN6 基因用T4DNA 連接酶連接。將含TRV2-SLPIN6 基因載體的大腸桿菌用平板涂布法涂在固體LB 培養(yǎng)皿（含50 μg·mL-1卡那霉素）上，將固體LB 培養(yǎng)皿放于恒溫培養(yǎng)箱中，避光靜置一夜（12 h左右）。當(dāng)固體LB 培養(yǎng)皿長出密集菌落時，使用已滅菌槍頭在固體LB培養(yǎng)皿上挑出單菌落，加入含液體LB的3 mL 離心管內(nèi)。將3 mL 離心管封口放置于置漂板上，放于恒溫?fù)u床（37 ℃，220 r·min-1）擴繁13 h。將擴繁后大腸桿菌菌液吸取1.5 mL 送往北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 侵染菌液制備

向農(nóng)桿菌感受態(tài)中加入10 μLSLPIN6 質(zhì)粒，隨后將含有SLPIN6 基因農(nóng)桿菌菌液涂布于含有抗生素固體LB培養(yǎng)皿上，將固體LB培養(yǎng)皿密封放置于恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃）培養(yǎng)36 h，直至長出單菌落時取出。挑取單株菌落置于3 mL 含有抗生素（50 μg·mL-1）液體LB 中，置于恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速220 r·min-1，溫度30 ℃）中擴繁16～18 h。將擴繁后農(nóng)桿菌菌液倒入20 mL液體LB（卡那霉素：50 μg·mL-1，利福平：25 μg·mL-1）中，放置于恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速220 r·min-1，溫度30 ℃）中擴繁17～19 h。將農(nóng)桿菌菌液離心，棄上清液，加入含有抗生素25 mL IM 液體，將菌體重懸，并于恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速220 r·min-1，溫度30 ℃）中搖18 h，直至農(nóng)桿菌液變?yōu)辄S色絮狀為準(zhǔn)。將培養(yǎng)后菌液再次離心（轉(zhuǎn)速10 000 g，10 min）。倒出上清液，向離心管中加入25 mL IM培養(yǎng)基，重新吹散菌落。酶標(biāo)儀檢測吸光度，所需吸光度為0.3。將TRV1 菌液分別與TRV2-PDS、TRV2空載農(nóng)桿菌菌液、TRV2-SLPIN6菌液1∶1 混勻。將混勻后菌液放入4 ℃冰箱靜置一夜后，隔日采用抽真空法侵染番茄植株，選取具有無損傷，無其他病害，生長健壯，生長勢相同四片真葉和兩片子葉番茄幼苗侵染。被侵染番茄植株黑暗保濕72 h有利于侵染轉(zhuǎn)化。72 h后正常植株管理，光照14 h、黑暗10 h 交替，溫度保持16～25 ℃為宜，濕度為60%。

1.2.3 基因沉默植株效率檢測

在番茄植株注射農(nóng)桿菌液后20 d左右，TRV2-PDS 苗葉片開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，即認(rèn)為SLPIN6 沉默植株已有沉默表達(dá)趨勢。此時采集TRV2空載植株、SLPIN6 沉默植株葉片置于1.5 mL 離心管中臨時存放。將番茄葉片RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自北京擎科生物科技有限公司）加樣反轉(zhuǎn)錄成cD?NA，作qRT-PCR檢測，儀器采用I5實時熒光定量儀。SLPIN6基因與內(nèi)參基因Actin-2基因序列如表2所示。相對表達(dá)量運用熒光定量PCR儀所測定Ct值（采用2-ΔΔCt方法[18]）計算分析。選擇基因表達(dá)量50%以下番茄苗開展后續(xù)試驗。

表2 SLPIN6基因熒光定量PCR引物Table 2 SLPIN6 gene fluorescence quantitative PCR primers

1.2.4 番茄植株干旱脅迫處理

選取基因沉默成功番茄植株（基因表達(dá)量50%以下）作模擬干旱處理，將野生型植株和TRV2 空載植株作為對照組，將對照組番茄植株和基因沉默番茄植株放入20% PEG 6000 溶液作逆境脅迫處理，選取0、3、6 h 番茄葉片，放于-80 ℃冰箱保存，每個處理3 次重復(fù)。對3 個時間點（0、3、6 h）SLPIN6 沉默植株、TRV2 空載植株和野生型植株觀察拍照。

1.3 生理指標(biāo)測定

1.3.1 SOD、POD、PRO、MDA含量測定

測定與植物抗逆相關(guān)生理指標(biāo)SOD、POD、PRO、MDA。按照試劑盒（購于北京擎科生物技術(shù)有限公司）操作流程測定相應(yīng)指標(biāo)。根據(jù)模擬干旱處理后，表型差異最明顯時間點，測定野生型對照植株，TRV2空載對照植株及SLPIN6基因沉默植株葉片生理指標(biāo)。

1.3.2 活性氧染色觀察

選取表型差異最明顯時間點番茄葉片染色處理，將對照組番茄葉片和沉默番茄葉片分別置于DAB和NBT溶液黑暗處放置10 h；倒出DAB和NBT溶液，加入30 mL無水乙醇，100 ℃水浴12 min，每隔3 min震動一次，若褪色不完全可將葉片用無水乙醇清洗一次。用鑷子將完全褪色后葉片放于載玻片上，觀察記錄拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRV2-PDS白化現(xiàn)象

如圖1所示，當(dāng)番茄植株培養(yǎng)19 d時，TRV2-PDS番茄植株從最上端葉片邊緣出現(xiàn)白化，之后陸續(xù)向其他分支葉片蔓延變白。番茄葉片白化現(xiàn)象說明指示基因PDS在番茄幼苗中已被成功沉默，作為參考，表明侵染過的番茄植株可開展后續(xù)試驗。

圖1 番茄苗白化現(xiàn)象Fig.1 Albinism of tomato seedlings

2.2 沉默植株脅迫處理后表型觀察

如圖2所示，與空載對照植株和野生型對照植株相比，SLPIN6基因沉默植株在3 h出現(xiàn)輕微倒伏現(xiàn)象，葉片開始萎蔫，6 h 莖彎曲程度加重，番茄植株倒伏加重，番茄植株萎蔫失水嚴(yán)重，與對照植株表型差異明顯。

圖2 干旱處理下對照組和SLPIN6基因沉默植株表型對比Fig.2 Comparison of phenotypes between control group and SLPIN6 gene silenced plants under drought treatment

2.3 沉默植株脅迫處理后基因表達(dá)量檢測

如圖3 所示，SLPIN6 基因在野生型對照植株和TRV2 空載對照植株表達(dá)量無明顯差異（0、3 和6 h）。與0 h相比，SLPIN6基因在3和6 h表達(dá)量顯著上調(diào)，在6 h基因表達(dá)量最高，說明SLPIN6基因與抗旱密切相關(guān)。SLPIN6 基因沉默植株的基因表達(dá)量在0、3和6 h均顯著低于對照植株組，說明沉默植株SLPIN6基因幾乎不表達(dá)。

圖3 干旱脅迫下基因表達(dá)量變化Fig.3 Changes of gene expression under drought stress

2.4 基因沉默植株脅迫處理后生理指標(biāo)測定結(jié)果

SOD 測定結(jié)果見圖4A，逆境處理前，SLPIN6基因沉默植株SOD 含量高于野生型對照植株、空載對照植株，逆境處理6 h，所有植株SOD 含量降低，SLPIN6 基因沉默植株降低幅度相對較少，SOD 含量仍高于對照植株，推測SLPIN6 基因影響SOD酶活性。

POD測定結(jié)果如圖4B所示，模擬干旱前，所有番茄植株中POD 酶活性相近，無明顯差異。逆境處理后，POD 酶含量顯著上升，SLPIN6 基因沉默植株P(guān)OD 含量是0 h 兩倍以上，可見SLPIN6 基因?qū)OD影響較大。

MDA 測定結(jié)果見圖4C，干旱脅迫處理0 h時，SLPIN6基因沉默植株MDA 含量低于野生型對照植株、空載對照植株，干旱脅迫處理6 h，檢測SLPIN6沉默植株中MDA 含量顯著升高，并與對照植株差異明顯。

Pro 測定結(jié)果如圖4D 所示，脅迫處理0 h 時，對照植株與SLPIN6 基因沉默植株中Pro 含量相同，無明顯差異。干旱脅迫處理6 h 后，3 種試驗材料Pro 活性均有所上升，SLPIN6 基因沉默植株P(guān)ro 含量上升幅度小。

圖4 干旱脅迫前后SOD、POD、MDA、Pro活性Fig.4 Activities of SOD，POD，MDA and Pro before and after drought stress

2.5 活性氧染色結(jié)果

干旱迫處理0 和6 h 下DAB 溶液染色觀察結(jié)果見圖5，對照植株和SLPIN6 沉默植株在0 h 葉片顏色無明顯差別，對照植株在干旱處理6 h后僅葉片邊緣出現(xiàn)紅棕色斑紋，而SLPIN6 基因沉默植株在6 h 葉片中間出現(xiàn)大量紅棕色斑紋。圖6 為干旱迫處理下NBT溶液染色情況。干旱處理前，SLPIN6基因沉默植株葉片斑紋略多，與對照植株相比并無明顯染色差異，當(dāng)干旱處理時間達(dá)到6 h，SLPIN6 沉默植株與對照植株相比，葉片出現(xiàn)大范圍染色，且染色程度更深。

圖5 DAB染色Fig.5 DAB staining

圖6 NBT染色Fig.6 NBT staining

3 討論與結(jié)論

番茄原產(chǎn)于南美洲西部高原地帶，干旱環(huán)境使番茄產(chǎn)量大幅減少，因此研究番茄抗旱基因尤為重要。本試驗通過對SLPIN6 基因抗旱功能驗證，為探索番茄抗旱性生理機制、培育新抗旱品種及提高番茄水分利用率等提供新理論依據(jù)。PIN蛋白家族作為植物激素輸出載體之一，通過介導(dǎo)細(xì)胞間生長素極性運輸調(diào)控生長素在植物組織間差異分布，調(diào)控植物生長發(fā)育[19]。目前PIN蛋白家族功能已有許多報道。譚彬等研究發(fā)現(xiàn)桃PIN家族與玉米PIN 家族均具有15 個成員且關(guān)系較近，通過順勢作用原件預(yù)測得出桃PIN蛋白家族不僅受脫落酸、茉莉酸甲酯等植物激素影響，還受鹽、低溫、干旱等順勢作用原件調(diào)控[20]。高堃等研究發(fā)現(xiàn)油菜PIN家族中部分成員可增強植株抗旱性，且油菜PIN家族蛋白序列與番茄PIN家族相似，推測番茄PIN 與油菜PIN 同源基因可能有相似的抗旱功能[21]。目前為止，VIGS技術(shù)已在番茄抗旱育種中廣泛應(yīng)用。本試驗將SLPIN6 基因通過VIGS 技術(shù)沉默，通過Q-PCR熒光驗證，得出SLPIN6 基因在野生型對照植株、TRV2空載植株基因表達(dá)量上調(diào)極顯著，說明SLPIN6 基因與抗旱密切相關(guān)。通過觀察表型發(fā)現(xiàn)，與野生型對照植株、TRV2 空載植株比，SLPIN6 沉默植株在6 h 出現(xiàn)明顯萎蔫現(xiàn)象，說明SLPIN6 基因表達(dá)量降低對番茄抗旱能力影響較大。

從4 個生理指標(biāo)結(jié)果分析可知，干旱處理6 h時，SLPIN6沉默植株與TRV2空載植株、野生型對照植株相比各指標(biāo)差異明顯，說明SLPIN6 基因表達(dá)量下調(diào)對番茄抗旱產(chǎn)生較大影響。SOD 增強機體對外界環(huán)境適應(yīng)力，是植物體內(nèi)重要抗氧化酶[21]。干旱處理后，SLPIN6 基因沉默植株比對照植株下降幅度少，SLPIN6 基因表達(dá)下降影響植物體內(nèi)抗旱SOD 酶活性，影響植株抗逆。過氧化物酶POD 是植物體內(nèi)普遍存在的氧化還原酶，逆境條件下，POD結(jié)合酶類物質(zhì)保護(hù)植物[22]。本試驗表明，逆境處理6 h后，所有番茄植株P(guān)OD含量均上升，SLPIN6 沉默植株上升含量明顯低于對照，說明SLPIN6 基因表達(dá)量變化可能參與POD 酶形成。MDA 是一類膜脂過氧化最終產(chǎn)物，MDA 在植物體內(nèi)含量變化與逆境傷害關(guān)系密切[23]。0 h 處理時，SLPIN6 沉默植株MDA 含量比對照植株含量略低，使用15%PEG 處理6 h，SLPIN6 沉默植株MDA 含量上升相對較多，SLPIN6 基因下調(diào)降低番茄抗旱性。植物體內(nèi)Pro 變化影響植物抗旱性，干旱情況下，植物體內(nèi)形成脯氨酸，因此測定Pro 含量變化可作為番茄抗逆生理指標(biāo)之一[24]。干旱脅迫處理后，對照植株P(guān)ro 上升兩倍以上，沉默植株上升幅度較少。推測SLPIN6 基因影響植物體內(nèi)Pro 含量，對番茄抗旱性產(chǎn)生影響。本試驗測定干旱脅迫下番茄植株SOD、POD、PRO、MDA 含量變化，得出SLPIN6 基因?qū)Ψ阎参锟购档挠绊懩芰Α?/p>

活性氧是植株在逆境條件下產(chǎn)生的一類有毒產(chǎn)物，以O(shè)2-·和H2O2為主[25]。植物細(xì)胞中過氧化物酶活性檢測通常采用DAB 染色法。DAB 溶液與過氧化氫反應(yīng)生成一種紅褐色聚合物，通過觀察葉片紅褐色深淺了解葉片中過氧化氫生成狀況。葉片中O2-·經(jīng)NBT染色后呈藍(lán)色。通過染色葉片深淺程度可直觀反映植物受損狀態(tài)。干旱處理前，沉默番茄葉片染色程度相差小。干旱處理后，沉默番茄葉片染色程度顯著高于對照植株。通過兩種染色變化得出，沉默SLPIN6 基因可影響番茄體內(nèi)活性氧含量，對番茄抗旱性發(fā)揮作用。

本研究通過對SLPIN6基因抗旱功能作VIGS驗證，通過各時間點基因表達(dá)量變化、番茄苗表型變化和生理指標(biāo)測定表明，SLPIN6 基因沉默后使番茄抗旱能力顯著下降，因此推斷SLPIN6 基因與番茄抗旱密切相關(guān)。為更深入了解SLPIN6 基因抗旱功能，后續(xù)將采用過表達(dá)、基因編輯等技術(shù)作功能驗證。