雪來(lái)提·派祖拉，艾司克爾·阿尤甫，伊麗娜，許文婷，張晨光，蔣威華，歐江華

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 乳腺外科二病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830000

乳腺癌是一類起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居女性惡性腫瘤首位[1]。目前，乳腺癌的常規(guī)篩查多借助X線、超聲等影像學(xué)手段，但在早期乳腺癌檢出敏感性和準(zhǔn)確性方面均無(wú)法滿足臨床需要[2]。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)代表人體外周血腫瘤細(xì)胞，主要來(lái)源于原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移瘤，并能夠作為腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[3]。cf DNA是指循環(huán)血中細(xì)胞外游離的片段化DNA，已被用于多種腫瘤的輔助診斷[4]。有研究證實(shí)，CTCs和cf DNA均可用于惡性腫瘤的輔助診斷及預(yù)后評(píng)估[5]。本研究旨在探討外周血CTCs與不同片段長(zhǎng)度cf DNA診斷乳腺癌的臨床價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 將新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院自2019年1月至2021年1月收治的42例乳腺癌患者納入惡性組，將同期收治的60例乳腺良性疾病患者納入良性組，將同期60例健康體檢者納入健康組。惡性組和良性組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)及病理組織學(xué)檢查確診為乳腺癌或乳腺良性疾??；年齡18～75歲；于我院完成CTCs和cf DNA檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；合并免疫或血液系統(tǒng)疾??；妊娠或哺乳期女性。惡性組年齡31～73歲，平均年齡(53.60±9.24)歲；腫瘤最大徑<5 cm 30例，腫瘤最大徑≥5 cm 12例；TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。良性組年齡33～75歲，平均年齡(52.90±9.67)歲；乳腺小葉增生27例，乳腺囊腫18例，乳腺纖維腺瘤8例，乳腺炎7例。健康組年齡30～74歲，平均年齡(51.86±9.10)歲。3組研究對(duì)象年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法及觀察指標(biāo) 比較3組的外周血CTCs陽(yáng)性率、cf DNA水平，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線評(píng)估外周血CTCs、cf DNA單用及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷效能。采集3組研究對(duì)象晨起空腹血液4～5 ml，采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)法完成DNA提取，試劑盒由Invitrogen提供，采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)完成外周血cf DNA檢測(cè)。采用qPCR檢測(cè)cf DNA中241 bp和100 bp片段表達(dá)量，內(nèi)參采用β-actin，計(jì)算241 bp/100 bp hTERT以評(píng)價(jià)血漿cf DNA完整性。外周血CTCs檢測(cè)采用Veridex公司Cell Search檢測(cè)系統(tǒng)，采集7.5 ml血漿與6.5 ml緩沖液混合后3 000 r/min離心10 min，吸取上清檢測(cè)。CTCs陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：每7.5 ml外周血中檢出≥1.0個(gè)CTCs[6]。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血CTCs陽(yáng)性率比較 惡性組、良性組、健康組的外周血CTCs陽(yáng)性率分別為38.1%(16/42)、16.7%(10/60)、13.3%(8/60)，惡性組外周血CTCs陽(yáng)性率高于良性組、健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組外周血cf DNA水平比較 惡性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于良性組，良性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組外周血cf DNA水平比較

2.3 外周血cf DNA對(duì)乳腺癌預(yù)測(cè)價(jià)值 100 bp hTERT預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線下面積最小，為0.873(0.766～0.980)，臨界值為31.25 ng/ml；241 bp hTERT預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線下面積為0.908(0.825～0.991)，臨界值為7.36 ng/ml；241 bp/100 bp hTERT預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線下面積最大，為0.919(0.833～0.998)，臨界值為0.22 ng/ml。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血cf DNA對(duì)乳腺癌預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線

2.4 外周血CTCs、cf DNA單用及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌診斷效能 以ROC曲線臨界值作為外周血cf DNA的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，CTCs聯(lián)合100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT診斷乳腺癌的效能最高，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別達(dá)95.24%、91.67%、93.14%。見(jiàn)表2。

表2 外周血CTCs、cf DNA單用及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌診斷效能

3 討論

乳腺癌現(xiàn)已成為導(dǎo)致女性死亡的主要惡性腫瘤類型，乳腺癌根治術(shù)聯(lián)合術(shù)后輔助治療作為首選方法在延長(zhǎng)患者生存時(shí)間和降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面顯示出良好獲益[7-8]，但仍有部分晚期患者無(wú)法完成手術(shù)切除，預(yù)后較差[9]。乳腺癌的早期篩查以影像學(xué)檢查為主，同時(shí)輔以部分血清學(xué)指標(biāo)，但整體檢出準(zhǔn)確率較低，存在局限性[10-11]。因此，尋找敏感的特異標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)乳腺癌早期準(zhǔn)確檢出已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

CTCs是外周血中檢測(cè)出的一組異質(zhì)腫瘤細(xì)胞，主要來(lái)源于原發(fā)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶脫落細(xì)胞[12]。有研究報(bào)道，CTCs與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，并可用于惡性腫瘤的輔助診斷及預(yù)后評(píng)估[13-14]。本研究中：惡性組外周血CTCs陽(yáng)性率高于良性組、健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這證實(shí)，外周血CTCs與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其陽(yáng)性常預(yù)示腫瘤細(xì)胞已經(jīng)由原發(fā)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶轉(zhuǎn)移至外周血。cf DNA屬于游離核酸，其來(lái)源包括壞死、凋亡的腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞自身合成分泌，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助診斷[15]。本研究通過(guò)檢測(cè)100 bp和241 bp hTERT目的基因來(lái)評(píng)價(jià)血漿cf DNA的含量及完整性，結(jié)果顯示：惡性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于良性組，良性組100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT水平均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即乳腺癌患者外周血cf DNA含量和完整性均較乳腺良性疾病患者和健康人群更高，間接支持了cf DNA含量和完整性與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死及轉(zhuǎn)移過(guò)程中均可能將大量游離DNA片段釋放至外周血，同時(shí)，惡性腫瘤患者外周血DNA酶抑制劑水平往往較高，而這一狀態(tài)能夠抑制游離DNA降解，導(dǎo)致cf DNA水平和完整性提高[16-17]。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示：100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.873(0.766～0.980)、0.908(0.825～0.991)、0.919(0.833～0.998)。即100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT對(duì)乳腺癌具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。ROC曲線分析結(jié)果還顯示：100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC曲線臨界值分別為31.25 ng/ml、7.36 ng/ml、0.22 ng/ml，以臨界值作為外周血cf DNA的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，CTCs聯(lián)合100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT診斷乳腺癌的效能最高，高于CTCs、100 bp hTERT、241 bp hTERT、241 bp/100 bp hTERT、CTCs聯(lián)合100 bp hTERT、CTCs聯(lián)合241 bp hTERT、CTCs聯(lián)合241 bp/100 bp hTERT，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別高達(dá)95.24%、91.67%、93.14%。分析其原因：外周血CTCs水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系更為密切，轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs陽(yáng)性比例相對(duì)較高[18]，而本研究納入的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者較少，影響了CTCs對(duì)于乳腺癌的診斷價(jià)值。因此，臨床乳腺癌篩查中應(yīng)優(yōu)先選擇外周血cf DNA檢測(cè)。

綜上所述，外周血CTCs聯(lián)合不同片段長(zhǎng)度cf DNA對(duì)于乳腺癌具有較高的診斷效能。本研究存在一定不足：納入樣本量較少，且為單中心回顧性研究，結(jié)論無(wú)法排除偏倚因素影響，有待后續(xù)更大規(guī)模、更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯空撟C。