薛向東,吳迎爽,馬 君,程淵博,王利紅,楊素娟
張家口市第一醫(yī)院 1.兒科;2.泌尿外科;3.腎內(nèi)科,河北 張家口075000
支氣管哮喘是小兒呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病之一,14歲以下兒童發(fā)病率約為4%。支氣管哮喘可嚴(yán)重影響患兒學(xué)習(xí)、運(yùn)動、飲食,甚至睡眠[1]。目前,支氣管哮喘的病因及具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,其可能與多種復(fù)雜因素有關(guān),除環(huán)境因素誘發(fā)外,包括基因多態(tài)性在內(nèi)的遺傳因素也是導(dǎo)致該病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)3屬于核轉(zhuǎn)錄因子,與生理功能、感染及腫瘤發(fā)生有關(guān),同時,其基因多態(tài)性可能影響多種免疫系統(tǒng)疾病的易感性[3-4]。本研究旨在探討小兒支氣管哮喘發(fā)病與STAT3等位基因的相關(guān)性。現(xiàn)報道如下。
1.1 一般資料 選取自2018年1月至2021年1月于張家口市第一醫(yī)院就診的86例小兒支氣管哮喘患兒納入哮喘組。另選取同期體檢的100例健康兒童納入健康組。哮喘組中,男性46例,女性40例;年齡4~9歲,平均年齡(6.30±1.35)歲。健康組中,男性55例,女性45例;年齡5~8歲,平均年齡(6.19±1.27)歲。兩組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有研究對象家屬均簽署知情同意書。
1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 哮喘組患兒納入標(biāo)準(zhǔn):符合兒童變應(yīng)性哮喘診斷及分度標(biāo)準(zhǔn)[5];年齡≤14歲;自愿加入研究;臨床資料完整。哮喘組患兒排除標(biāo)準(zhǔn):川崎??;炎癥性腸??;其他免疫系統(tǒng)疾病。健康組納入標(biāo)準(zhǔn):年齡≤14歲;于我院體檢證實健康無疾??;近4周無感染或發(fā)熱;自愿加入研究;臨床資料完整。健康組排除標(biāo)準(zhǔn):近4周使用激素或免疫抑制劑;過敏體質(zhì);其他免疫系統(tǒng)疾病史。
1.3 研究方法
1.3.1 DNA提取及引物設(shè)計 抽取研究對象外周靜脈血2 ml,EDTA抗凝,吸取200 μl提取目標(biāo)DNA,-80℃保存;引物設(shè)計和引物設(shè)計合成均由Invitrogen公司完成,包含基因多態(tài)性位點質(zhì)控正向引物和通用反向引物。
1.3.2 SSP-PCR檢測 SSP-PCR反應(yīng)體系包括模板DNA 2 μl、2×PowerTaq Master Mix 12.5 μl、特異性引物0.5 μl、質(zhì)控正向引物0.5 μl及通用反向引物1 μl,以dd H2O補(bǔ)足25 μl。內(nèi)含子11 rs2293152位點擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s連續(xù)8個循環(huán),60℃退火45 s,73℃延伸45 s;94℃變性30 s連續(xù)25個循環(huán),52℃退火45 s,73℃延伸45 s,73℃延伸5 min。內(nèi)含子23 rs957970位點擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s連續(xù)35個循環(huán),50℃退火45 s,73℃延伸45 s,73℃延伸5 min。
1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠(15 g/L)中加入PCR產(chǎn)物5 μl,電泳電壓和時間分別設(shè)置為110 V、35 min。電泳完成后切取目標(biāo)條段經(jīng)凝膠成像儀顯像。
1.3.4 PCR產(chǎn)物測序及驗證 STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點和內(nèi)含子23 rs957970位點隨機(jī)抽樣3份樣本,完成包含上述位點產(chǎn)物擴(kuò)增,產(chǎn)物測序和驗證均由英濰捷基完成直接測序,將測序SNP位點基因型結(jié)果和SSP-PCR檢測結(jié)果對比驗證。
1.3.5 血清炎癥因子水平檢測 抽取晨起空腹外周靜脈血3 ml,離心(3 000 r/min、10 min)后采用ELISA法測定血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5、γ干擾素(interferon γ,IFN-γ)水平。
2.1 H-W遺傳平衡檢驗分析 H-W遺傳平衡檢驗分析顯示,健康組STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率和內(nèi)含子23 rs957970位點基因型分布頻率均符合H-W平衡(χ2值分別為0.700、0.255,P>0.05);哮喘組STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率和內(nèi)含子23 rs957970位點基因型分布頻率均符合H-W平衡(χ2值分別為0.279、1.211,P>0.05)。證實納入兒童具有人群代表性。
2.2 兩組內(nèi)含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比較 哮喘組與健康組內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型、等位基因(C、G)比例比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。存在C等位基因的小兒支氣管哮喘發(fā)生風(fēng)險為G等位基因的1.62倍(比值比=1.62,95%可信區(qū)間1.10~2.89)。
表1 兩組內(nèi)含子11 rs2293152 C/G基因型及等位基因分布比較/例(百分率/%)
2.3 兩組內(nèi)含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比較 兩組內(nèi)含子23 rs957970位點基因型(CC、CT、TT)及等位基因(C、T)比例比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 兩組內(nèi)含子23 rs957970 C/T基因型及等位基因分布比較/例(百分率/%)
2.4 內(nèi)含子11 rs2293152位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 內(nèi)含子11 rs2293152位點CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于GG患者,血清IFN-γ水平低于GG患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型患者血清IL-4、IL-5水平高于CG患者,血清IFN-γ水平低于CG患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 內(nèi)含子11 rs2293152位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較
2.5 內(nèi)含子23 rs957970位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 內(nèi)含子23 rs957970位點CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。
表4 內(nèi)含子23 rs957970位點不同基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較
近年來,支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年升高的趨勢,已逐漸成為全球性公共衛(wèi)生問題[6]。支氣管哮喘常會對兒童正常的生長發(fā)育及身心健康造成負(fù)面影響。學(xué)齡前兒童常因喘息癥狀就診,根據(jù)進(jìn)展階段,臨床將喘息分為一過性、持續(xù)性及遲發(fā)性喘息或哮喘3類[7]。遲發(fā)性喘息患兒如僅合并特應(yīng)性因素,進(jìn)展成為支氣管哮喘風(fēng)險較高。針對此類患兒,早期診治有助于預(yù)防支氣管哮喘發(fā)病,但如何實現(xiàn)早期準(zhǔn)確的預(yù)測仍無合適的指標(biāo)[8]。支氣管哮喘可能屬于多基因相關(guān)遺傳性疾病,患兒直系親屬發(fā)病比例最高接近75%[9]。近年來,候選基因定位克隆研究不斷深入,已成為分析疾病易感基因的主要方法,而支氣管哮喘發(fā)病的候選基因超過200個,包括人類白細(xì)胞抗原Ⅱ、腫瘤壞死因子α及IL等,涉及到機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫識別及信號傳導(dǎo)等多方面生物學(xué)改變[10-11]。
STAT3屬于DNA結(jié)合蛋白,廣泛表達(dá)于人體內(nèi)多種組織及細(xì)胞,其能夠在無功能狀態(tài)下接收胞外信號刺激后磷酸化。磷酸化的STAT3能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合特異DNA片段,調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá),影響細(xì)胞增殖分化,腫瘤及感染的發(fā)生、進(jìn)展等[12-13]。有研究報道,敲除模型動物呼吸道上皮平滑肌細(xì)胞STAT3基因,經(jīng)塵螨抗原刺激后,呼吸道反應(yīng)性顯著下降,提示STAT3可能在支氣管哮喘呼吸道高反應(yīng)性中發(fā)揮著一定作用[14-16]。
SSP-PCR檢測技術(shù)用于基因多態(tài)性位點檢測結(jié)果與直接測序法檢測基本一致,且具有檢測效率高,價格較為低廉等優(yōu)勢[17-18]。本研究通過SSP-PCR法檢測STAT3基因多態(tài)性,并進(jìn)一步分析該基因多態(tài)性與小兒支氣管哮喘易感性的關(guān)系,結(jié)果顯示,小兒支氣管哮喘患兒STAT3基因內(nèi)含子11 rs2293152位點和內(nèi)含子23 rs957970位點均存在基因多態(tài)性,但內(nèi)含子11 rs2293152位點基因型分布頻率與既往研究[19]報道不一致,原因可能與納入患兒種族和地區(qū)差異有關(guān)。
本研究中,哮喘組內(nèi)含子11 rs2293152位點CC基因型、C等位基因比例顯著高于健康組(P<0.05),存在C等位基因的小兒支氣管哮喘發(fā)生風(fēng)險為G等位基因的1.62倍,進(jìn)一步說明內(nèi)含子11 rs2293152位點C/G基因型中的C等位基因可能是小兒支氣管哮喘發(fā)生的易感基因,針對此類人群,早期干預(yù)有助于降低支氣管哮喘發(fā)生風(fēng)險。但兩組內(nèi)含子23 rs957970位點基因型和等位基因比例比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),可基本排除內(nèi)含子23 rs957970位點基因多態(tài)性對小兒支氣管哮喘發(fā)病風(fēng)險的影響。本研究結(jié)果顯示,內(nèi)含子23 rs957970位點CC、CT、TT基因型患者血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);內(nèi)含子11 rs2293152位點CC、CG基因型患者血清IL-4、IL-5高于GG患者,血清IFN-γ低于GG患者(P<0.05),CC基因型患者血清IL-4、IL-5高于CG患者,血清IFN-γ低于CG患者(P<0.05),提示基因多態(tài)性與哮喘患者的氣道炎癥有關(guān),CC基因型患者的氣道炎癥最為嚴(yán)重。有研究報道,STAT3可通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子等介導(dǎo)哮喘患者的氣道炎癥反應(yīng),因此,STAT3基因多態(tài)性與哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度有較大的相關(guān)性[20],與本研究結(jié)果一致。STAT3基因多態(tài)性對STAT3信號通路的調(diào)控作用不同,內(nèi)含子11 rs2293152位點上的C等位基因可通過對STAT3信號通路較強(qiáng)的激活作用介導(dǎo)氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞或氣道炎癥細(xì)胞浸潤,從而加重哮喘患者病情,因此,CC基因型患者的氣道炎癥相對更嚴(yán)重[21]。
綜上所述,小兒支氣管哮喘發(fā)病與STAT3基因多態(tài)性有關(guān),內(nèi)含子11 rs2293152位點的C等位基因?qū)儆谝赘谢?,且該位點的基因多態(tài)性會影響哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)。