馮麗萍 張輝潔 歐雯婷 余 盈（廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心，湛江 524000）

2018年數據顯示，全球因肝癌死亡人數高達78.2萬，而我國占50%以上［1］。肝癌是我國癌癥死亡的重要原因之一，且其發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高，嚴重威脅人們身體健康和生命安全［2］。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一種小包膜正鏈單股RNA病毒，其感染是除乙型肝炎病毒外誘發(fā)肝癌的另一大危險因素；HCV核心蛋白（HCV core protein，HCVc）是HCV編碼的一種多功能蛋白，可通過與細胞內信號通路相互作用調控相關因子表達，影響細胞增殖和凋亡等生物學行為，導致肝癌發(fā)生［3］。因此，深入研究HCVc促進肝癌發(fā)生的分子機制對HCV感染相關性肝癌防治具有重要意義。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類非編碼RNA，可通過與靶基因3'UTR特異性結合在轉錄后水平調控其表達發(fā)揮作用，其異常表達與HCV感染相關性肝癌發(fā)生聯系密切［4］。研究指出，miR-486-5p在肝癌中異常低表達且可抑制HepG2細胞生長［5］；另外，原發(fā)性外周血單個核細胞中人類免疫缺陷病毒和HCV共同感染可引發(fā)miR-486-5p表達下調［6］；但HCV單獨感染是否影響肝癌miR-486-5p表達尚未明確。研究顯示，HCV感染可引起肝組織中醛酮還原家族1B10（aldehyde reductase family 1 member B10，AKR1B10）表達上調，而AKR1B10在肝癌中異常高表達，且可通過調控HepG2細胞增殖和凋亡發(fā)揮重要促癌作用［7-9］。本研究采用生物信息學軟件探索miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR的互補結合位點，推測miR-486-5p與AKR1B10的可能靶向關系，HCV感染可能通過調控肝癌中miR-486-5p/AKR1B10發(fā)揮致癌作用，因此，本研究擬通過HCVc腺病毒感染人肝癌細胞株HepG2，觀察miR-486-5p和AKR1B10表達變化及兩者作用關系，以期為HCV感染相關性肝癌發(fā)生機制和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2購于寧波明舟生物科技有限公司（貨號：ATCC HB-8065）；EMEM培養(yǎng)基購于上海子起生物科技有限公司（貨號：30-2003）；胎牛血清購于上海生工生物工程股份有限公司（貨號：E510002-0100）；重組腺病毒Ad-GFPHCVc（滴度為1×1011pfu/ml）和陰性對照腺病毒Ad-GFP（滴度為1×1011pfu/ml）由長沙艾碧維生物科技有限公司旗下奧諾基因合成（貨號：均為HGrAd003167）；脂質體3000、Trizol試劑、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、通用RT-PCR試劑盒、MTT試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司（貨號：L3000008、15596018、D0010、RP1100、M1020-500T、CA1020-20T）；SYBR Green定量PCR試劑盒購于北京金福賽生物科技有限公司（貨號：GF1051）；miR-486-5p模擬物、模擬物陰性對照miR-NC、miR-486-5p抑制劑和抑制劑陰性對照購于南通百奧邁科生物技術有限公司（貨號：CS7004、CS7005、CS8004、CS8005）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與腺病毒感染 采用含10%胎牛血清的EMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞（37℃、5%CO2、95%相對濕度）。將長勢良好的指數期HepG2細胞按1×105個/孔平鋪于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁，以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為20、40、60、80和100對HepG2細胞進行GFP腺病毒感染，感染48 h后采用熒光顯微鏡觀察感染效率。

1.2.2 實驗分組與處理 實驗分為空白組：正常培養(yǎng)不進行感染；陰性對照組：感染陰性對照腺病毒Ad-GFP；HCVc組：感染重組腺病毒Ad-GFPHCVc，每組設3個重復。按1×105個/孔取指數期HepG2細胞接種至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁，根據實驗分組分別加入Ad-GFP、Ad-GFP-HCVc腺病毒（MOI=60）培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT-PCR檢測HepG2細胞中HCVc基因表達收集處理后的3組HepG2細胞，加入1 ml Trizol試劑提取總RNA，參照RT-PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，并將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增條件為：94℃6 min，94℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，72℃5 min，38個循環(huán)。PCR擴增引物HCVc基因（長度180 bp）F：5'-CAACGCAAACCAAAATGCGA-3'，R：5'-CTTTCGGAATCGGCTGAC-3'；內參GAPDH基因（長度217 bp）F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，R：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。實驗重復3次。

1.2.4 MTT法檢測HepG2細胞增殖 將指數期HepG2細胞調整濃度為1×105個/ml，200μl/孔接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，按1.2.2分組處理；分別在腺病毒感染細胞48 h、72 h和96 h時，參照MTT試劑盒說明書采用酶標儀檢測HepG2細胞增殖活力，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡 收集腺病毒感染48 h后的3組HepG2細胞，預冷磷酸緩沖液漂洗2次，嚴格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測HepG2細胞miR-486-5p表達采用Trizol法提取3組HepG2細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，參照SYBR Green定量PCR試劑盒說明書采用熒光定量PCR儀進行擴增，以U6為內 參，2-ΔΔCt法計 算HepG2細胞miR-486-5p表達。擴增條件為：94℃2 min，94℃10 s、60℃30 s，40個循環(huán)。PCR擴增引物序列：miR-486-5p F：5'-CATTGTGCTGTTCGTGCAGTTAA-3'，R：5'-CCCTCCAGGAATTGGCCTGTCTT-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢 測HepG2細 胞HCVc和AKR1B10蛋白表達 收集處理后的3組HepG2細胞，加入細胞裂解液抽提總蛋白，二奎啉甲酸法對總蛋白進行定量；將蛋白樣品和上樣緩沖液按1∶1混合，進行SDS-PAGE電泳分離，半干法轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，轉入1∶1 000稀釋的一抗（HCVc、AKR1B10、GAPDH）4℃孵育過夜，轉入1∶2 000稀釋的二抗（辣根過氧化物酶標記）室溫孵育2 h，顯影；以GAPDH為內參，Quantity one軟件分析HepG2細胞HCVc和AKR1B10蛋白表達。實驗重復3次。

1.2.8 細胞轉染 將指數期HepG2細胞平鋪至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70%融合，參照脂質體3000說明書將miR-486-5p抑制劑及其陰性對照轉染至HepG2細胞，命名為anti-miR-486-5p組和anti-miRNC組，以正常培養(yǎng)不進行轉染的HepG2細胞作為對照組，每組設3個復孔。轉染48 h后收集3組細胞，RT-qPCR檢測miR-486-5p表達，Western blot檢測AKR1B10蛋白表達。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因實驗 將含miR-486-5p和AKR1B10結合位點序列和定點突變序列克隆重組至pmirGLO載體，構建pmirGLO-AKR1B10野生型載體質粒（AKR1B10-Wt）和pmirGLO-AKR1B10突變型載體質粒（AKR1B10-Mut）；參照脂質體3000說明書將miR-486-5p模擬物、模擬物陰性對照miR-NC分別與AKR1B10-Wt、AKR1B10-Mut共轉染至HepG2細胞（每組設3個復孔），轉染48 h后，采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測各處理組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GFP腺病毒感染效果 采用Ad-GFP腺病毒在MOI=60時感染HepG2細胞48 h，熒光顯微鏡觀察顯示感染效率達95%以上（圖1A）。RT-PCR和Western blot檢測結果顯示，空白組和陰性對照組細胞中未見HCVc mRNA和蛋白表達，而HCVc組細胞中可見HCVc mRNA和蛋白表達（圖1B、C）。

圖1 腺病毒感染效果Fig.1 Adenovirus infection effect

2.2 HCVc促進肝癌HepG2細胞增殖并抑制其凋亡 腺病毒感染48 h、72 h和96 h時，陰性對照組和空白組細胞增殖活力差異無統計學意義（P＞0.05），但HCVc組細胞增殖活力明顯高于陰性對照組（P＜0.05）；陰性對照組和空白組細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05），但HCVc組細胞凋亡率明顯低于陰性對照組（P＜0.05，圖2、表1）。

表1 HCVc對HepG2細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

表1 HCVc對HepG2細胞增殖和凋亡的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of HCVc on proliferation and apoptosis of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc FP OD490 48 h 0.62±0.03 0.60±0.04 0.73±0.061）21.689＜0.001 72 h 0.89±0.06 0.93±0.05 1.35±0.101）108.894＜0.001 96 h 1.19±0.13 1.22±0.15 1.68±0.151）32.903＜0.001 Apoptosis rate（%）9.52±1.16 8.75±1.23 3.02±0.211）117.323＜0.001

圖2 流式細胞術檢測結果Fig.2 Flow cytometry results

2.3 HCVc下調肝癌HepG2細胞miR-486-5p表達，上調AKR1B10蛋白表達 與空白組相比，陰性對照組細胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與陰性對照組相比，HCVc組細胞miR-486-5p表達明顯降低，而AKR1B10蛋白表達明顯升高（P＜0.05，圖3、表2）。

表2 HCVc對HepG2細 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

表2 HCVc對HepG2細 胞miR-486-5p和AKR1B10蛋 白表達的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of HCV on miR-486-5p and AKR1B10 protein expressions of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negative control HCVc F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.08 0.41±0.041）378.788＜0.001 AKR1B10 protein 0.48±0.04 0.46±0.03 0.89±0.071）214.905＜0.001

圖3 Western blot檢測AKR1B10蛋白表達Fig.3 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.4 下調miR-486-5p表達可上調HepG2細胞AKR1B10蛋白表達 與對照組相比，anti-miR-NC組細胞miR-486-5p和AKR1B10蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與anti-miR-NC組相比，antimiR-486-5p組細胞miR-486-5p表達明顯降低，而AKR1B10蛋白表達明顯升高（P＜0.05，圖4、表3）。

表3 下調miR-486-5p表達對HepG2細胞AKR1B10蛋白表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

表3 下調miR-486-5p表達對HepG2細胞AKR1B10蛋白表達的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of miR-486-5p down-regulation on AKR1B10 protein expression of HepG2 cells（±s，n=9）

Note：1）P＜0.05 vs anti-miR-NC group.

Groups Control anti-miR-NC anti-miR-486-5p F P miR-486-5p 1.00±0.00 0.98±0.09 0.19±0.031）640.300＜0.001 AKR1B10 protein 0.43±0.03 0.45±0.04 0.78±0.061）171.000＜0.001

圖4 Western blot檢測AKR1B10蛋白表達Fig.4 AKR1B10 protein expression detected by Western blot

2.5 miR-486-5p可與AKR1B10靶向結合Target-Scan軟件預測結果顯示，miR-486-5p和AKR1B10 3'UTR存在互補結合位點（圖5）；與模擬物陰性對照miR-NC相比，共轉染miR-486-5p模擬物與AKR1B10-Wt質粒細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），但共轉染miR-486-5p模擬物與AKR1B10-Mut質粒細胞熒光素酶活性無明顯改變（P＞0.05，圖6）。

圖5 miR-486-5p與AKR1B10存在互補結合位點Fig.5 There were complementary binding sites between miR-486-5p and AKR1B10

圖6 各組細胞熒光素酶活性Fig.6 Luciferase activity of cells in each group

3 討論

HCVc是一種反式激活蛋白，不僅可通過影響HCV感染細胞的基因表達，還可通過形成同二聚體結構、異二聚體結構或多聚體結構干擾細胞內信號通路轉導調節(jié)細胞周期、凋亡等過程，進而發(fā)揮致癌作用［10］。本研究采用HCVc重組腺病毒感染HepG2細胞，細胞增殖活力明顯增強，凋亡能力明顯降低，表明HCVc具有促進HepG2細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，與XU等［11］報道的HCVc可通過上調miR-196a靶向FOXO1促進HepG2細胞異常增殖的結果以及FENG等［12］報道的HCVc可通過調控sirt1-p53-bax通路抑制HepG2細胞凋亡的結果一致。

miRNAs是一類與肝癌發(fā)生密切相關的非編碼RNA［13］。HCVc可通過調控部分miRNAs表達發(fā)揮致癌作用。如SHIU等［14］報道，HCVc可通過下調miR-138表達抑制肝癌細胞復制性衰老；WANG等［15］研究指出，HCVc可通過調節(jié)TGFBRAP1和HOTTIP表達影響參與調控致癌進展的miR-122和miR-204表達；HUANG等［16］發(fā)現，HCVc可通過下調miR-152表達調節(jié)Wnt1表達促進肝癌細胞異常增殖。miR-486-5p是在肝癌中異常低表達的miRNA，可通過調控相關靶基因（如PIK3R1、H3F3B、NEK2等）抑制癌細胞增殖和誘導細胞凋亡［5，17-18］；但miR-486-5p是否參與HCVc致癌機制尚未闡明。本研究進一步檢測發(fā)現，HCVc重組腺病毒感染后，HepG2細胞miR-486-5p表達下調，表明HCVc可抑制HepG2細胞miR-486-5p表達。提示HCVc促進肝癌發(fā)生的分子機制可能與下調肝癌中的抑癌基因miR-486-5p表達有關。

AKR1B10是一種醛酮還原酶，不僅在調節(jié)視黃酸代謝和促進脂質合成等過程中發(fā)揮重要作用，還在包括肝癌在內的多種腫瘤細胞中發(fā)揮重要致癌作用［19-20］。本研究進一步檢測發(fā)現，HCVc可上調HepG2細胞AKR1B10蛋白表達，與SATO等［21］研究所得出的HCVc可上調肝組織中AKR1B10表達結果一致。同時鑒于錢瑞坤等［8］研究證實，AKR1B10在肝癌中可通過調控HepG2細胞增殖和凋亡發(fā)揮促癌作用，提示HCVc促進肝癌發(fā)生過程中，其可能通過增強促癌因子AKR1B10表達使AKR1B10的致癌作用增強進而促進肝癌發(fā)生。本研究通過轉染miR-486-5p抑制劑下調miR-486-5p表達后發(fā)現，HepG2細胞中AKR1B10蛋白表達明顯升高，表明miR-486-5p低表達可促進HepG2細胞AKR1B10蛋白表達。另外，本研究通過生物信息學軟件預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證發(fā)現，miR-486-5p可與AKR1B10靶向結合，表明AKR1B10是miR-486-5p的潛在靶基因。提示肝癌發(fā)生過程中，低表達miR-486-5p可能通過靶向上調促癌因子AKR1B10蛋白表達發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，HCVc可引起HepG2細胞miR-486-5p表達下調和AKR1B10蛋白表達上調，AKR1B10是miR-486-5p的潛在靶基因，HCVc促進HepG2細胞增殖并抑制細胞凋亡的作用機制可能與調控miR-486-5p/AKR1B10有關。但HCVc是直接還是間接調控miR-486-5p表達有待進一步探討。