胡長(zhǎng)容,周艷艷,付佳琳,任靜雯,劉陽(yáng)陽(yáng),黃旭博,袁俊俊

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450002;2.河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 102618)

卵巢儲(chǔ)備功能減退(diminished ovarian reserve,DOR)是指卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞的數(shù)量減少和/或質(zhì)量下降,伴抗苗勒管激素(AMH)水平降低、竇卵泡數(shù)(AFC)減少、卵泡刺激素(FSH)水平升高,表現(xiàn)為生育能力下降,但不強(qiáng)調(diào)年齡、病因和月經(jīng)改變[1]。目前,該病趨于年輕化,如果未能及早發(fā)現(xiàn)并治療,可在1～6年內(nèi)發(fā)展為卵巢早衰甚至卵巢功能衰竭[2]。西醫(yī)常采用激素替代療法(HRT)和輔助生殖技術(shù)(ART)治療,但存在周期取消率高、臨床妊娠率、抱嬰率低等情況[3]。DOR可歸于中醫(yī)“月經(jīng)過(guò)少”“閉經(jīng)”“不孕癥”“絕經(jīng)前后諸證”等范疇。基于“治未病”思想,對(duì)于DOR患者應(yīng)做到早診斷、早治療,發(fā)揮中醫(yī)藥特色,積極調(diào)整其月經(jīng),保留育齡期女性的剩余卵巢功能,改善妊娠結(jié)局。

仙茅-淫羊藿藥對(duì)始載于?本草綱目?,是上海中醫(yī)藥大學(xué)張伯訥教授創(chuàng)制的二仙湯中的核心組方,是常用的補(bǔ)腎陽(yáng)藥對(duì)。研究表明,淫羊藿中的主要有效成分淫羊藿苷和仙茅中的仙茅乙醇提取物均有類激素樣雙向調(diào)節(jié)作用[4]。周艷艷教授認(rèn)為,DOR的病因責(zé)之于腎陰陽(yáng)兩虛,腎精、腎陰是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ),腎中陽(yáng)氣是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的動(dòng)力;腎精充足和腎陰、腎陽(yáng)的平衡與否,與卵巢儲(chǔ)備功能、卵子發(fā)育成熟密切相關(guān)。因此,臨床組方補(bǔ)腎精時(shí),常加用仙茅-淫羊藿藥對(duì),使陰陽(yáng)互助而泉源不竭,從而達(dá)到調(diào)整卵巢功能、促進(jìn)內(nèi)分泌水平恢復(fù)的效果。

仙茅-淫羊藿藥對(duì)用于臨床療效確切,但其作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是多學(xué)科相互滲透,運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫(kù)及各項(xiàng)技術(shù),揭示藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系預(yù)測(cè)藥物的作用機(jī)制,用以尋找高效低毒藥物的一門新興學(xué)科[5]。臨床上目前對(duì)于DOR的病因、病機(jī)、診療方案尚無(wú)規(guī)范化的認(rèn)識(shí),故本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討仙茅-淫羊藿治療DOR的作用機(jī)制,旨在為臨床治療DOR提供新思路。

1 研究方法

1.1 仙茅、淫羊藿相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP,http://tcmspw．com/tcmsp．php)檢索仙茅、淫羊藿的化學(xué)成分,以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,獲取活性成分及蛋白質(zhì)靶點(diǎn),在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)中將化合物對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化,將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”。

1.2 DOR相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“diminished ovarian reserve”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索,挖掘人類基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards,https://www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https://www.omim.org)、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(DiSGeNET,http://www.disgenet.org)中DOR的相關(guān)靶點(diǎn),合并疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后去重,得到DOR的靶點(diǎn)信息,在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 仙茅、淫羊藿-DOR靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將仙茅、淫羊藿活性成分作用靶點(diǎn)與DOR相關(guān)靶點(diǎn)取交集,并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)并構(gòu)建蛋白-蛋白交互(PPI)網(wǎng)絡(luò),將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”,最小互相作用閾值設(shè)定為“medium confidence”＞0.4,其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置,得到PPI網(wǎng)絡(luò)后通過(guò)Cytoscape 3.7.2對(duì)其進(jìn)行分析,篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 仙茅-淫羊藿與疾病交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將1.3中獲取的交集靶點(diǎn)與相對(duì)應(yīng)的藥物活性成分錄入Cytoscape3.7.2,構(gòu)建藥物成分與靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)獲得治療DOR可能發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.5 仙茅、淫羊藿-DOR關(guān)鍵靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 將仙茅-淫羊藿藥對(duì)治療DOR的靶點(diǎn)錄入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org),物種信息選擇為“H.sapiens”,對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析,設(shè)置P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 仙茅-淫羊藿藥對(duì)活性成分信息 經(jīng)A DME屬性篩選后共獲得仙茅中的活性成分7種(剔除缺乏靶點(diǎn)信息成分MOL004146,余6種),淫羊藿中的活性成分23種,包括槲皮素(quercetin)、木犀草素(Luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等,見表1。仙茅作用靶點(diǎn)61個(gè),淫羊藿作用靶點(diǎn)221個(gè),合并去重后得到作用靶點(diǎn)228個(gè)。

表1 仙茅-淫羊藿藥對(duì)活性成分信息

2.2 DOR靶點(diǎn) 從OMIM、GeneCards、DiSGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取DOR靶點(diǎn)145、1 093、43個(gè),將所得數(shù)據(jù)合并去重后進(jìn)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范,選擇生物種類“Homo sapiens”,最終得到1 138個(gè)DOR相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 仙茅、淫羊藿-DOR靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將篩選的仙茅-淫羊藿活性成分靶點(diǎn)與DOR疾病靶點(diǎn)通過(guò)Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集并繪制韋恩圖。將獲得128個(gè)交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0平臺(tái),得到仙茅、淫羊藿-DOR的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoScape 3.7.2進(jìn)行可視化分析,該網(wǎng)絡(luò)圖包括128個(gè)節(jié)點(diǎn)與2 271條相互作用關(guān)系連線,節(jié)點(diǎn)大小與靶點(diǎn)蛋白的度值呈正相關(guān)。掃描題目右側(cè)二維碼查看圖1—3。

2.4 仙茅-淫羊藿藥對(duì)與疾病交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析 仙茅-淫羊藿藥對(duì)與DOR交集靶點(diǎn)共128個(gè),與其相關(guān)的藥物活性成分是XM1、XM2、XM3、XM4、XM6、YYH5、YYH6、YYH8、YYH11、YYH21、YYH23。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包括141個(gè)節(jié)點(diǎn),267條邊,度值較高的活性成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇。掃描題目右側(cè)二維碼查看圖4。

2.5 靶點(diǎn)功能與通路富集分析 仙茅-淫羊藿藥對(duì)主要參與的生物信息學(xué)過(guò)程(BP)包括對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)(responsETo toxic substance)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)(responsETo inorganic substance)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)(cellular responsETo organic cyclic compound)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)(responsETo lipopolysaccharide)、對(duì)氧氣水平的反應(yīng)(responsETo oxygen levels)、血液循環(huán)(blood circulation)、凋亡信號(hào)通路(apoptotic signaling pathway)等。分子功能(MF)包括細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、蛋白質(zhì)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)、G蛋白耦合胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合(protein kinase binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)等。細(xì)胞組成(CC)包括膜筏(membrane raft)、突觸前膜的積分成分(integral component of presynapticmembrane)、囊腔(vesicle lumen)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)(perinuclear region of cytoplasm)、蛋白激酶復(fù)合物(protein kinase complex)等。參與的富集通路主要有癌癥途徑、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路、核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路掃描題目右側(cè)二維碼查看圖4。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,仙茅-淫羊藿藥對(duì)廣泛用于治療臨床各科疾病,包括骨質(zhì)疏松癥、卵巢早衰、抑郁癥等[5-7]。本研究結(jié)果顯示,仙茅-淫羊藿藥對(duì)治療DOR的主要活性成分可能為槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇等,主要靶點(diǎn)可能為 AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3等,可能參與的通路有癌癥途徑、AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。由此可見,仙茅-淫羊藿藥對(duì)治療DOR是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑來(lái)達(dá)到治療效果的。

槲皮素是一種黃酮類化合物,具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基及類雌激素樣作用[8]。槲皮素既可改變卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡的比例及卵巢分化,又可抑制卵泡閉鎖,影響相關(guān)激素的分泌,達(dá)到抑制卵泡發(fā)育的作用[9]。β-谷甾醇可作用于卵巢顆粒細(xì)胞,促進(jìn)其產(chǎn)生雌二醇(E2),具有雌激素活性[10]。

蛋白激酶B(AKT1)是PI3K/AKT信號(hào)通路中重要的下游靶激酶,位于通路的核心位置,參與細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控,當(dāng)AKT1正常表達(dá)時(shí),可以維持原始卵泡正常的生長(zhǎng)發(fā)育,調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和顆粒細(xì)胞增殖分化,并可抑制細(xì)胞凋亡;當(dāng)AKT1表達(dá)異常時(shí),會(huì)使原始卵泡生長(zhǎng)發(fā)育失常,導(dǎo)致卵巢發(fā)生病理性改變,加速卵巢衰老[11]。白細(xì)胞介素(IL-6)是一種多效性細(xì)胞因子,是PI3K/AKT通路的上游調(diào)控因子,參與人體免疫調(diào)節(jié),且在卵泡閉鎖中起著至關(guān)重要的作用[12]。有研究表明,IL-6等炎癥因子是引起免疫性卵巢早衰的關(guān)鍵[13]。腫瘤相關(guān)蛋白TP53的一個(gè)同系物TAp63是脫氧核糖核酸(DNA)損傷凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,當(dāng)細(xì)胞DNA受損時(shí),TAp63與磷酸化的非受體酪氨酸激酶c-Abl相互作用,激活下游信號(hào)分子促凋亡基因,誘發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),直接或間接促使卵巢儲(chǔ)備功能降低[14]。TP53也與卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與增殖密切相關(guān)[15]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)是對(duì)血管形成具有特異性的重要作用因子,可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及增殖促進(jìn)血管新生[16]。卵泡的發(fā)育過(guò)程與血管新生密切相關(guān),卵泡周圍血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育障礙將導(dǎo)致卵泡顆粒細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致卵泡閉鎖。胱天蛋白酶3(CASP3)是胱天蛋白酶(CASP)家族中的一個(gè)凋亡效應(yīng)因子,在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),主要參與細(xì)胞凋亡過(guò)程,當(dāng)CASP3系統(tǒng)被激活時(shí)可觸發(fā)細(xì)胞凋亡,加速卵巢早衰[17]。仙茅-淫羊藿藥對(duì)可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上主要靶點(diǎn)而發(fā)揮治療DOR的作用。

PI3K/AKT是最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和其他相關(guān)病理、生理過(guò)程[18]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和下游效應(yīng)器蛋白激酶(AKT)屬于一個(gè)保守的家庭信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。卵母細(xì)胞中的PI3K信號(hào)能控制原始卵泡的存活、丟失和激活[19]。PI3K可以激活磷酸肌苷依賴激酶-1/2(PD K 1/2),然后磷酸化AKT的兩個(gè)關(guān)鍵蘇氨酸和絲氨酸殘基。在卵巢中,AKT是PI3K/AKT通路中的重要激酶,并且在人類卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)。AKT具有廣泛的底物,在卵泡激活過(guò)程中具有直接和間接的作用。原始卵泡激活支配著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及周圍體細(xì)胞顆粒細(xì)胞的分化和增殖,因此這兩個(gè)過(guò)程都是實(shí)現(xiàn)排卵的必要過(guò)程。此外,研究表明,該通路在免疫和自身免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。當(dāng)超過(guò)10%的顆粒細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí),卵泡可能處于閉鎖狀態(tài),提示顆粒細(xì)胞凋亡是各發(fā)育階段卵泡閉鎖的主要機(jī)制。此外,顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞成熟提供必要的生長(zhǎng)信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)。顆粒細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)卵泡發(fā)育至關(guān)重要,其本質(zhì)上是減少顆粒細(xì)胞凋亡,修復(fù)原始卵泡儲(chǔ)備池,是修復(fù)卵巢功能的主要機(jī)制。PI3K/AKT通路參與代謝、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)發(fā)育等過(guò)程,并調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)方面,如凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化。此外,PI3K/AKT通路參與卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、原始卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖和凋亡。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞毒性藥物通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡,增加卵巢功能早衰發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[21]。HIF-1是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子,由氧敏感亞基HIF-1 α和芳基烴核轉(zhuǎn)位器HIF-1β組成。HIF-1的激活可以保護(hù)神經(jīng)元免于凋亡,可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。一方面,HIF-1可能通過(guò)抑制細(xì)胞色素C的釋放、DNA修復(fù)酶PA R P的切割和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(CASPa Se)的激活來(lái)阻止凋亡細(xì)胞的死亡;另一方面,HIF-1可能通過(guò)抑制P53的激活來(lái)維持細(xì)胞生存。HIF-1激活后,葡萄糖運(yùn)輸和糖酵解流量的增加也與組織活力和細(xì)胞存活有關(guān)[22]。HIF-1通路中特定的轉(zhuǎn)錄因子被激活,可誘導(dǎo)卵巢中HIF-1 αm R NA和蛋白表達(dá)增加,并在顆粒細(xì)胞中進(jìn)行特異性表達(dá),表明HIF-1信號(hào)通路可能直接作用于卵巢,促進(jìn)卵巢發(fā)揮其生理功能,從而防止卵巢早衰[23-24]。在卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,細(xì)胞凋亡起重要作用[25],顆粒細(xì)胞凋亡率過(guò)高影響卵母細(xì)胞發(fā)育,這可能是因?yàn)轭w粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞凋亡信息。NF-κB是體內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,參與多種基因調(diào)控、機(jī)體免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[26-27]。NF-κB對(duì)細(xì)胞凋亡存在雙向調(diào)節(jié),既可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,也可以抑制細(xì)胞凋亡。由此可見,PI3K-AKT信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路對(duì)卵泡的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。

仙茅-淫羊藿藥對(duì)是臨床常用的補(bǔ)腎陽(yáng)藥對(duì),本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,初步預(yù)測(cè)了此藥對(duì)作用于DOR的基本藥理學(xué)作用機(jī)制,為臨床組方提供了新的思路。因數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)有限等客觀原因,其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究來(lái)闡明。