王 潔,裴 兵,孫 寧,王衛(wèi)萍，王 穎，李曉軍△

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇宿遷 223800；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床中心實(shí)驗(yàn)科，江蘇南京 210002

隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)逐年增多[1]，給感染的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]。在CRE的耐藥機(jī)制中，最主要是產(chǎn)碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)是目前研究最多也最為常見的碳青霉烯酶。目前，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的藥敏試驗(yàn)方法指導(dǎo)臨床用藥，存在著培養(yǎng)時間過長的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了臨床治療時效性。為了適應(yīng)臨床治療對快速檢測的需求，低成本、快速的側(cè)流層析(LF)技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展[3]。本研究將雙重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和LF技術(shù)有機(jī)結(jié)合，建立雙重PCR-LF方法檢測2種重要碳青霉烯酶基因(KPC和NDM)，實(shí)現(xiàn)在一個反應(yīng)體系中快速、特異地檢測2個靶標(biāo)基因，并將該方法直接用于臨床無菌體液標(biāo)本的檢測，為早期指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 攜帶KPC、NDM肺炎克雷伯菌，產(chǎn)KPC-2的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥標(biāo)準(zhǔn)肺炎克雷伯菌菌株ATCCBAA-1705，攜帶blaIMP的銅綠假單胞菌，攜帶blaVIM的惡臭假單胞菌，攜帶blaNDM-1的肺炎克雷伯菌均由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科微生物室保存。

1.2儀器與試劑 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)； PCR分析試劑盒(Takara公司)和DL2000 DNA標(biāo)記物(Takara公司)；TIANamp Blood DNA 檢測試劑盒(天根生物科技有限公司)；核酸染料GelRed(美國Biotium公司)。PCR擴(kuò)增儀(美國BioRad公司)、電泳儀(美國BioRad公司)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(Eppendorf5417R)；VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)；微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 將細(xì)菌接種于MH瓊脂平板上，分區(qū)劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落，將其懸浮于100 μL滅菌去離子水，100 ℃ 10 min，12 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至—20 ℃保存?zhèn)溆?。無菌體液標(biāo)本DNA按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.3.2引物 根據(jù)GenBank已發(fā)表的序列[4-6]，設(shè)計(jì)KPC、NDM引物。引物序列由上海Invotrigen公司合成。

1.3.3雙重PCR 擴(kuò)增體系(25.0 μL)：Premix Ex Tap Hot Start Version 12.5 μL，2種耐藥基因(KPC、NDM)的正向和反向引物(10 μmol/L)各加0.5 μL至同一反應(yīng)體系，1.0 μL DNA模板，加ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s,55～60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共計(jì)35個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3.4雙重PCR方法學(xué)評價(jià) 將攜帶KPC、NDM的肺炎克雷伯菌，按照上述1.3.1步驟進(jìn)行DNA提取后，檢測其水平，進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照建立的雙重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。

1.3.5LF試紙的制備與性能測試 以半抗原地高辛、熒光素與相應(yīng)抗體的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，制備LF試紙。在雙重PCR檢測KPC和NDM的研究基礎(chǔ)上，將上述KPC和NDM引物進(jìn)行標(biāo)記(KPC上下游引物分別標(biāo)記生物素和地高辛；NDM上下游引物分別標(biāo)記生物素和熒光素)，擴(kuò)增帶有雙標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，電泳后回收產(chǎn)物，利用NanoDrop-1000檢測其水平；而后進(jìn)行LF試紙的性能測試，以1 ng的雙標(biāo)記DNA產(chǎn)物為測試模板，首先分析不同抗體水平的檢測效果，兩條檢測線：T1為抗地高辛抗體，T2為抗熒光素抗體，質(zhì)控線C為生物素化的牛血清清蛋白(B-BSA)。

1.3.6雙重PCR-LF檢測KPC和NDM 采用雙重PCR-LF檢測標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株中的KPC和NDM基因。取雙重/單重PCR產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣在層析試紙條上，5～10 min后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3.7應(yīng)用雙重PCR-LF檢測臨床標(biāo)本 收集臨床微生物送檢無菌體液標(biāo)本120份(包括腦脊液、穿刺液、關(guān)節(jié)液、引流液等)，進(jìn)行DNA提取。按照上述建立起來的反應(yīng)體系，進(jìn)行雙重PCR-LF檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。將雙重PCR-LF的檢測結(jié)果與耐藥表型結(jié)果進(jìn)行配對比較，采用McNemar檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1雙重PCR檢測KPC和NDM方法學(xué)評價(jià) 雙重PCR檢測KPC和NDM的檢測限為200 CFU/mL，與常規(guī)單重PCR檢測結(jié)果一致，見圖1。

注：A為雙重PCR結(jié)果；B為常規(guī)PCR擴(kuò)增KPC；C為常規(guī)PCR擴(kuò)增NDM；M為DL1000 DNA 標(biāo)記物；7～1為梯度稀釋的產(chǎn)KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL) 。

2.2LF試紙的性能測試 LF試紙的性能測試結(jié)果表明，抗地高辛抗體、抗熒光素抗體和B-BSA的點(diǎn)樣水平分別為250、50、50 ng時效果最佳，見圖2。

圖2 不同抗體水平對檢測雙標(biāo)記DNA的影響

2.3雙重PCR-LF檢測KPC和NDM方法學(xué)評價(jià) 雙重PCR-LF檢測KPC和NDM，最低可檢測到200 CFU/mL的肺炎克雷伯菌，并且與其他超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因沒有交叉反應(yīng)，見圖3。

注：7～1為梯度稀釋的產(chǎn)KPC和NDM的肺炎克雷伯菌(2～2×106 CFU/mL)；A為雙重PCR-LF檢測結(jié)果；B為單重PCR-LF檢測KPC的結(jié)果；C為單重PCR-LF檢測DNM的結(jié)果。

2.4雙重PCR-LF與藥敏表型檢測結(jié)果比較 以藥敏表型為參考方法，雙重PCR-LF檢測的靈敏度為69.39%，特異度為92.96%，Kappa值為0.644，兩種方法結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 雙重PCR-LF與藥敏表型檢測結(jié)果比較(n)

3 討 論

據(jù)2017年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，在臨床常見細(xì)菌感染中，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物(對亞胺培南、美羅培南或厄他培南任意一種藥物耐藥)的耐藥率分別為1.5%、9.0%、20.7%和56.1%。就江蘇省而言，碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率高于全國平均水平，這一現(xiàn)象對當(dāng)?shù)鼐用竦慕】岛透腥究刂圃斐闪藝?yán)重威脅[7-10]。因此，迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確的碳青霉烯酶基因檢測方法，指導(dǎo)臨床用藥，縮短TAT時間，避免抗菌藥物的濫用，預(yù)防產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌暴發(fā)性感染。

常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室多采用藥敏表型檢測的方法指導(dǎo)抗菌藥物使用，需要進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，整個檢測流程時間較長，且易產(chǎn)生假陰性[11]，易延誤治療。多重PCR可一次擴(kuò)增多種耐藥基因，提高檢測效率同時降低檢測成本，減輕患者負(fù)擔(dān)[5]。然而多重PCR仍存在一定不足，例如：常規(guī)的多重PCR技術(shù)需采用電泳或測序進(jìn)行產(chǎn)物分析，實(shí)時熒光PCR技術(shù)需要配有熒光檢測通道的PCR儀器，存在著操作煩瑣、易污染等問題，且需要嚴(yán)格的操作流程和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求。

本研究將雙重PCR檢測方法和LF技術(shù)相結(jié)合。LF技術(shù)主要分為兩類，一類是以堿基互補(bǔ)配對原則為反應(yīng)基礎(chǔ)的核酸LF技術(shù)(NALFT)；另一類是以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的LF技術(shù)(NALFIA)，即在雙鏈DNA上標(biāo)記半抗原或生物素，而后利用生物素-親和素反應(yīng)或半抗原-抗體的免疫反應(yīng)，以膠體金或量子點(diǎn)等作為標(biāo)記物，進(jìn)行核酸檢測，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、可視化的檢測需求。

本研究建立的雙重PCR-LF方法直接用于無菌體液標(biāo)本的檢測，結(jié)果顯示，LF試紙能夠快速有效檢測到耐藥基因KPC和NDM，與藥敏表型檢測結(jié)果的Kappa值為0.644，一致性較好，且靈敏度達(dá)69.39%，特異度達(dá)92.96%，可為臨床用藥提供依據(jù)。但是本研究發(fā)現(xiàn)，部分無菌體液標(biāo)本的藥敏表型為耐藥表型，但雙重PCR-LF方法檢測結(jié)果為陰性。分析原因：一是細(xì)菌的耐藥方式并不僅局限于產(chǎn)碳青霉烯酶[12]；二是本研究建立的方法不能包含全部的碳青霉烯酶基因。但是隨著細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)KPC和NDM是較為常見和分布較廣的碳青霉烯酶[2,13-14]。因此，從一定程度上講，多重PCR-LF可以滿足臨床檢測碳青霉烯酶基因的需求。

綜上所述，本研究建立的雙重PCR-LF方法檢測時間約為3 h，且靈敏度、特異度均達(dá)到較高水平，實(shí)現(xiàn)了碳青霉烯酶基因的快速檢測，可在臨床藥敏結(jié)果出來之前，指導(dǎo)臨床用藥，避免抗菌藥物的濫用。同時，該檢測方法也為今后在一個反應(yīng)體系納入3種及以上的耐藥基因檢測方法提供了思路與基礎(chǔ)。