葉挺宇，黃航，潘悅，蔡冰

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，浙江 溫州 325015

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，具有多中心性、易復(fù)發(fā)性、惡性程度高的特點(diǎn)，明確膀胱癌的發(fā)生機(jī)制對于膀胱癌診療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一類核苷酸長度超過200 nt，但不參與編碼蛋白的RNA。近年研究顯示，LncRNA的異常表達(dá)在多種腫瘤的進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，linc00346與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]，但其具體分子機(jī)制尚不明確。PTEN是一種腫瘤抑制基因，定位于染色體10q23.3，具有雙重特異性磷酸酶活性，在對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠影響細(xì)胞的遷移、增殖及凋亡等重要過程[3]。本研究探討linc00346通過靶向PTEN調(diào)控PI3K/Akt通路對膀胱癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本：膀胱癌組織標(biāo)本來源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科根治性膀胱全切術(shù)后經(jīng)病理確診為膀胱尿路上皮癌的手術(shù)存檔標(biāo)本，共30例。配對的癌旁正常組織來源于同一患者的手術(shù)標(biāo)本，距離膀胱癌瘤體3 cm以上，并經(jīng)病理確診為正常組織。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

1.1.2 膀胱癌細(xì)胞系：人膀胱癌細(xì)胞系T24購自美國ATCC細(xì)胞庫（北京中原公司代理）。

1.1.3 主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)、胎牛血清（美國Gibco公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），GV248慢病毒載體系統(tǒng)（上海吉?jiǎng)P基因公司），SF1670（美國InvivoChem），Prime ScriptTMRT Master Mix（日本Takara公司），兔抗PTEN、p-Akt、Akt單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）試劑盒（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將T24細(xì)胞株置于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：沉默linc00346表達(dá)的慢病毒載體GV248-linc00346-shRNA的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司完成。調(diào)整細(xì)胞密度，以5×104細(xì)胞/孔接種于6孔板，按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染慢病毒載體至T24細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組情況：①空白對照組（Control）：未轉(zhuǎn)染慢病毒；②陰性對照組（Scramble）：轉(zhuǎn)染無關(guān)序列shRNA；③shRNA組：轉(zhuǎn)染干擾linc00346-shRNA。空白對照組中加入PTEN特異性抑制劑SF1670（PTEN inhibitor組），以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測目的基因表達(dá)量：取組織標(biāo)本或?qū)?shù)生長期的各組T24細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明書操作，提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。按照Prime ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。β-actin引物序列為F：5’-GAAATCG TGCGTGACATTAA-3’，R：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；linc00346引物序列為F：5’-AGCTTGAATGGCGTTGGAAC CTATAG-3’，R：5’-ATAGTCCCTTCCTCGAATCCTAGT-3’；PTEN引物序列為F：5’-GGGACGAACTGGTGTAATGA-3’，R：5’-CGCCTCTGACTGGGAATAG-3’。目的基因的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測PTEN和PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平：取對數(shù)生長期的各組T24細(xì)胞，采用BCA法測定各組及標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白濃度。加樣（50 μg/孔），制備SDS-PAGE膠，電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。于室溫下封閉2 h，加一抗（1:1 000），于4 ℃下孵育過夜。次日以TBST液洗膜3次，加二抗（1:4 000），室溫下孵育2 h，洗滌，ECL顯影。于Oddessy成像系統(tǒng)中掃膜，檢測條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力：將各組T24細(xì)胞以1×103/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，分別在細(xì)胞培養(yǎng)至1～7 d時(shí)，加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)孵育3 h。置入全自動(dòng)酶標(biāo)儀中，測定450 nm波長處各孔吸光度值（OD值），并以時(shí)間為橫軸、OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 linc00346 mRNA、PTEN mRNA在膀胱尿路上皮癌組織中的差異表達(dá) 癌組織中l(wèi)inc00346 mRNA的相對表達(dá)量為1.985±0.169，癌旁正常組織中的相對表達(dá)量為0.915±0.067，膀胱癌組織中l(wèi)inc00346 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.05），見圖1A。癌組織中PTEN mRNA的相對表達(dá)量為0.535±0.054，癌旁正常組織中的相對表達(dá)量為1.113±0.069，膀胱癌組織中PTEN mRNA的表達(dá)水平明顯較低（P＜0.05），見圖1B。

圖1 膀胱癌及膀胱組織中l(wèi)inc00346和PTEN的差異表達(dá)

2.2 抑制linc00346對PTEN表達(dá)和PI3K/Akt通路的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，shRNA組linc00346 mRNA的表達(dá)水平（0.397±0.023）與Control組（1.243±0.041）及Scramble組（1.237±0.021）比較顯著降低（均P＜0.05），Control組與Scramble組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A，說明沉默linc00346成功。與Control組（1.112±0.044）及Scramble組（1.131±0.026）比較，shRNA組（1.963±0.067）PTEN mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖2B。

圖2 抑制linc00346對PTEN表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組及Scramble組比較，shRNA組的PTEN蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），而總Akt蛋白水平變化不明顯（見圖3）。Control組與Scramble組間上述蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 沉默linc00346對PI3K/Akt信號通路的影響

2.3 PTEN抑制劑對PI3K/Akt通路的影響 予PTEN特異性抑制劑SF1670處理后，PTEN蛋白水平顯著下調(diào)，p-Akt蛋白水平明顯增加（P＜0.05），總Akt蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 PTEN抑制劑對PI3K/Akt信號通路的影響

2.4 linc00346和PTEN對T24細(xì)胞增殖的影響 沉默linc00346表達(dá)后，與Control組對比，shRNA組T24細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05），Scramble組細(xì)胞增殖無顯著變化（P＞0.05），見圖5A。給予PTEN抑制劑SF1670處理后，PTEN inhibitor組細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見圖5B。

圖5 linc00346和PTEN對T24細(xì)胞增殖的影響

3 討論

LncRNAs具有序列長、攜帶遺傳信息豐富、可折疊形成復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，從而能夠參與多種分子調(diào)控機(jī)制，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、免疫監(jiān)視等諸多關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。linc00346位于人類13號染色體長臂3區(qū)4帶，有研究報(bào)道其與小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃腸道腫瘤等多系統(tǒng)惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。我們的前期研究結(jié)果證實(shí)，linc00346在膀胱尿路上皮癌組織及細(xì)胞中異常高表達(dá)，并且能夠影響膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[2]。PTEN是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，主要通過參與PTEN/PI3K/Akt、PTEN/ERK、PTEN/FAK/P130cas以及p53/MDM2等多條信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成等負(fù)向調(diào)控效應(yīng)[8]。

本研究中，我們通過RT-PCR檢測膀胱癌組織標(biāo)本中l(wèi)inc00346和PTEN的相對表達(dá)量，驗(yàn)證了膀胱癌組織中存在linc00346高表達(dá)、PTEN低表達(dá)現(xiàn)象。應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞系中l(wèi)inc00346的表達(dá)后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白水平升高，PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵蛋白p-Akt水平下調(diào)，總Akt蛋白保持不變，而經(jīng)PTEN抑制劑處理后，p-Akt蛋白水平增加，證實(shí)了PTEN對PI3K/Akt通路的直接負(fù)性調(diào)控效應(yīng)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTEN水平升高可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力，提示linc00346可以通過PTEN調(diào)控PI3K/Akt通路來影響腫瘤細(xì)胞增殖。

PI3K/Akt是一條蛋白激酶偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，與細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期等生物學(xué)過程密切相關(guān)，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。PTEN同時(shí)具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性，被稱為雙重特異性磷酸酶[10]。PTEN正是利用其脂質(zhì)磷酸酶活性，使磷脂酰肌醇（3，4，5）三磷酸（PIP3）脫磷酸生成PIP2。PIP3是PI3K的代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)了Akt的活化過程，因此，PTEN可以通過降低PIP3的水平，減弱PI3K和Akt活化，抑制PI3K/Akt信號通路，最終達(dá)到加速細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等抑癌效應(yīng)[8，11-12]。據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，53%的原發(fā)性膀胱癌患者PTEN蛋白表達(dá)降低甚至缺失，94%的晚期膀胱癌中PTEN蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示PTEN基因缺失或受到抑制與膀胱癌的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，linc00346在膀胱癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，并可能通過抑制PTEN表達(dá)而激活PI3K/Akt信號通路，最終加速膀胱尿路上皮癌細(xì)胞增殖。