金燦，張仁侃，張開(kāi)睿，陳大慶

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury,TBI）指暴力（如高空墜落、車(chē)禍、運(yùn)動(dòng)等）因素造成腦實(shí)質(zhì)受損，從而導(dǎo)致感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙，炎癥反應(yīng)是其繼發(fā)性損傷的重要原因之一[1]。隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)表明，早期過(guò)度的炎癥激活將導(dǎo)致TBI預(yù)后不良，TBI患者血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）及白細(xì)胞介素-8（interleukin-8, IL-8）的高低與臨床預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）作為膜磷脂的重要組成成分，對(duì)中樞神經(jīng)的結(jié)構(gòu)完整和功能發(fā)育具有重要作用，能夠維持腦內(nèi)細(xì)胞膜的穩(wěn)定、保護(hù)相關(guān)膜蛋白功能、突觸傳遞等[4]。本研究探討DHA對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠腦立體定位打擊儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司），DHA鈉鹽（美國(guó)Sigma公司），TNF-α、IL-6、IL-10多克隆抗體（美國(guó)ProteinTech公司），二抗（英國(guó)Abcam公司），蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（南京碧云天生物科技公司），qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR定量混合液（中國(guó)臺(tái)灣Toyobo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立：選取體質(zhì)量18～20 g雄性C57BL/6N小鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009]，同等飼養(yǎng)條件下，自由飲水和飲食，飼養(yǎng)觀察7 d后，采用隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行分組，將小鼠分為假手術(shù)組（Sham）、造模組（TBI）、DHA給藥組（TBI+DHA），每組15只。術(shù)前常規(guī)禁食禁飲12 h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，采用異氟烷麻醉誘導(dǎo)后將小鼠固定于腦立體定位儀上，保持打擊器與小鼠顱骨垂直。剔除小鼠頭部毛發(fā)并用碘伏溶液消毒，沿正中做矢狀切口，用3%雙氧水腐蝕筋膜，充分暴露前囟及人字縫，在前囟后0.6 mm，中線旁開(kāi)10 mm，手持牙科水泥鉆鉆取一直徑約為4 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整，設(shè)定速度為4 m/s，深度為1 mm的打擊程序進(jìn)行顱腦打擊，隨后縫合線縫合切口，將其放到37 ℃電熱毯上蘇醒后放回鼠籠中飼養(yǎng)。Sham組僅去除顱骨，不進(jìn)行打擊。TBI+DHA組于打擊后30 min內(nèi)腹腔注射DHA鈉鹽溶液10 mg/（kg·d），持續(xù)3 d。Sham組和TBI組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：造模21 d后對(duì)各組小鼠進(jìn)行Garcia神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：自主活動(dòng)0～3分；四肢肢體運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱(chēng)性0～3分；前肢伸展情況0～3分；爬行能力0～3分；本體感覺(jué)反應(yīng)能力0～3分；觸須反應(yīng)能力0～3分；軀干側(cè)轉(zhuǎn)反應(yīng)能力0～3分。

1.2.3 組織HE染色：采用心臟灌流的方法處死小鼠，取腦組織固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，切片后保存。選取造模21 d后的腦組織進(jìn)行切片，在65 ℃干燥鼓風(fēng)烘箱中烘烤 30 min，二甲苯浸泡兩次透明，隨后梯度乙醇化。用蘇木素染色5～10 min，隨后用純化水沖洗，PBS返藍(lán)后，伊紅染液染色2 min，染色完成后梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡兩遍，中性樹(shù)脂封片鏡檢，顯微鏡下觀察。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)：造模完成后24 h，取小鼠大腦皮層組織，加入組織裂解液進(jìn)行裂解，并用勻漿機(jī)勻漿，4 ℃離心機(jī)按照12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，用BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白含量，配置電泳所需的蛋白樣品（40 μg）。配置適宜濃度的SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，TBST清洗，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，回收，TBST清洗PVDF膜，二抗室溫孵育1 h，曝光，使用Image-Lab軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）：造模完成后24 h，提取組織樣本中總RNA混入反轉(zhuǎn)錄試劑配置的反應(yīng)液，置入梯度PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA再與SYBR Green配置成20 μL的反應(yīng)體系，并置入實(shí)時(shí)定量PCR儀器中設(shè)置模板，開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄。PCR引物見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及組織缺損情況 與Sham組相比，TBI的Garcia評(píng)分顯著下降（P＜0.05），DHA藥物治療后，Garcia評(píng)分較前升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，與Sham組比，TBI組的小鼠大腦皮層組織明顯缺失，而給予DHA藥物治療后，大腦皮層組織破壞明顯減少，周?chē)梢?jiàn)增殖灶，可見(jiàn)組織增生（見(jiàn)圖2）。

圖1 各組小鼠Garcia神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（aP＜0.05）

圖2 各組小鼠海馬組織HE染色結(jié)果（×40，箭頭所示為破損與修復(fù)情況）

2.2 各組小鼠炎癥通路的激活情況 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比，TBI小鼠大腦皮層的促炎蛋白TNF-α、IL-6表達(dá)量上升，抗炎蛋白IL-10表達(dá)量下降（均P＜0.01）；與TBI組比，DHA干預(yù)后小鼠大腦皮層的TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)量顯著下降，IL-10蛋白表達(dá)量顯著升高（均P＜0.01）。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比，TBI小鼠大腦皮層TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)增加，IL-10表達(dá)減少（均P＜0.01）；與TBI組相比，DHA干預(yù)后小鼠TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)水平下降，IL-10表達(dá)水平升高（均P＜0.01）。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠大腦皮層中炎癥蛋白表達(dá)情況

圖4 RT-qPCR測(cè)定各組小鼠大腦皮層中炎癥基因表達(dá)情況（aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001）

3 討論

TBI的病理機(jī)制分為不可干預(yù)的原發(fā)性損傷和可逆轉(zhuǎn)的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷主要是指以血腦屏障的開(kāi)放為扳機(jī)點(diǎn)造成的一系列損傷，炎癥的過(guò)度激活是其中重要機(jī)制之一[1-2]。

TBI后早期炎癥小體的激活導(dǎo)致釋放TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子并在隨后的炎癥反應(yīng)中扮演著重要的角色[2，5]。TNF-α等促炎因子的釋放增加內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障的通透性加重腦水腫，同時(shí)也會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致炎癥過(guò)度反應(yīng)[6]。KHUMAN等[7]發(fā)現(xiàn)，TBI模型中，水迷宮結(jié)果顯示TNF-α敲除鼠較野生鼠認(rèn)知功能恢復(fù)更差，平臺(tái)潛伏時(shí)間更長(zhǎng)。WU等[8]發(fā)現(xiàn)TBI患者長(zhǎng)期慢性的炎癥水平即外周血清高水平的TNF-α與IL-13會(huì)影響重度TBI患者的意識(shí)水平恢復(fù)。以上研究表明TNF-α在TBI的功能恢復(fù)中扮演著重要的角色。ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是DHA，作為神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成成分，參與神經(jīng)突觸傳遞及腦內(nèi)代謝，具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞毒性、保護(hù)膜穩(wěn)定、神經(jīng)再生等功能[4]。近期一項(xiàng)薈萃分析顯示，靜脈注射劑量為250 nmol/kg或1 000 nmol/kg的DHA能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[9]。CAI等[10]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射DHA 10 mg/（kg·d），持續(xù)3 d，能夠改善急性腦卒中全身炎癥狀態(tài)，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和促炎細(xì)胞因子，促使巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型轉(zhuǎn)化。因此，我們推測(cè)DHA對(duì)TBI后神經(jīng)功能的恢復(fù)及損傷后炎癥通路具有調(diào)節(jié)作用。

本研究選取健康成年雄性C57BL/6N小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)建立穩(wěn)定的控制性皮層撞擊模型模擬TBI，采用腹腔注射DHA 10 mg/（kg·d）持續(xù)3 d，通過(guò)Garcia評(píng)分來(lái)初步探討DHA對(duì)TBI后運(yùn)動(dòng)感覺(jué)的修復(fù)情況，HE染色評(píng)估DHA對(duì)損失皮層細(xì)修復(fù)情況，Western blot及PCR探討其炎癥信號(hào)通路的激活。結(jié)果顯示，DHA能夠改善損傷后小鼠的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能，促進(jìn)皮層組織的增生，同時(shí)，減少大腦皮層中TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)，增加抗炎因子IL-10的表達(dá)。

綜上所述，小鼠腹腔注射DHA 10 mg/（kg·d），連續(xù)3 d，可以減少損傷后炎癥因子TNF-α、IL-6的激活，促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌，從而減輕炎癥造成的繼發(fā)性腦損傷，改善Garcia神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。