李肖曉，劉波，阿爾孜古麗?吐爾遜，張明琛

1新疆醫(yī)科大學(xué)健康管理學(xué)院，烏魯木齊 830000；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院；3中國科學(xué)院大學(xué)附屬寧波市華美醫(yī)院內(nèi)分泌科

人體脂肪組織具有可塑性，隨著體質(zhì)量增加、年齡增長，脂肪組織擴張，脂肪細胞的體積增大數(shù)目增多［1］。內(nèi)臟脂肪組織不僅是人體供能組織，還是重要的內(nèi)分泌器官。內(nèi)臟脂肪增加后，募集巨噬細胞等多種免疫細胞、分泌多種炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子［2］，激活體內(nèi)炎癥氧化反應(yīng)，促進了糖尿病、非酒精性脂肪肝病、冠心病等多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。小鼠胚胎成纖維細胞（3T3-L1）是一種脂肪干細胞、前體脂肪細胞，3T3-L1及其亞克隆系3T3-F442A［4］，以及辛普森變異綜合征嬰兒皮下脂肪干細胞［5］、成年人皮下脂肪干細胞［6］，都被用于研究脂肪細胞的功能代謝。但由于種屬不同或脂肪來源部位差異，這些脂肪細胞模型無法替代人內(nèi)臟脂肪細胞。若在體外予以適宜處理，人網(wǎng)膜組織即可成為理想的內(nèi)臟脂肪來源。本研究通過提取人網(wǎng)膜脂肪干細胞，并以3T3-L1作對照，將兩種細胞進行培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞，比較其增殖和分化情況，總結(jié)人網(wǎng)膜脂肪干細胞體外增殖分化特點，旨在可為后續(xù)研究人內(nèi)臟脂肪細胞代謝功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2021年1—3月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的因膽囊炎或膽囊結(jié)石需行外科手術(shù)治療的超重或者肥胖患者12例，男7例，女5例；年齡（49.16±14.22）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：18歲≤年齡<70歲，BMI≥24 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、肝腎功能不全及近半年體質(zhì)量變化>10%者。手術(shù)取腹腔內(nèi)大網(wǎng)膜脂肪組織0.5～2 g。小鼠來源的3T3-L1由新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究院細胞室提供。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Biological Indus‐tries公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），青霉素鏈霉素混合溶液（Hyclone公司），2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（Cell Counting Kit-8試劑盒，博奧森公司），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、地塞米松、10 mg/mL胰島素溶液（Sigma公司），油紅O染色液（Solarbio公司）。超凈工作臺，細胞培養(yǎng)箱，上海安亭TDL-5-A離心機，OLYMPUS IX73倒置顯微鏡，BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀。

1.3 細胞培養(yǎng)基、分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制 ①細胞培養(yǎng)基：取44.5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基、5 mL胎牛血清、500μL青霉素鏈霉素溶液，加入50 mL離心管中。②成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基：稱取IBMX 55.56 mg，加入無水乙醇5 mL，混勻溶解，配成0.05 mmol/mL的IBMX溶液。稱取吲哚美辛71.55 mg，加入無水乙醇1.43 mL，混勻溶解，配成0.14 mmol/mL吲哚美辛溶液。稱取地塞米松1 mg，加入無水乙醇1 mL，混勻溶解，配成1 mg/mL地塞米松溶液。取556μL的IBMX溶液、35μL吲哚美辛溶液、20μL地塞米松溶液、50μL胰島素溶液、500μL青霉素鏈霉素混合溶液、5 mL胎牛血清混合，再加入DMEM高糖培養(yǎng)基定容至50 mL，即配成分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其中IBMX最終濃度0.5 mmol/L，吲哚美辛最終濃度0.1 mmol/L，地塞米松最終濃度1 mmol/L，胰島素最終濃度10 mg/L。配成50 mL分化誘導(dǎo)液后，用0.22μm濾器過濾除菌。

1.4 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1體外培養(yǎng)及生長情況觀察 ①人網(wǎng)膜脂肪干細胞：a.原代培養(yǎng)：取患者的網(wǎng)膜脂肪組織2 g，置于培養(yǎng)皿中，滴加2 mL的PBS、1 mL的青霉素鏈霉素溶液，清洗大網(wǎng)膜的血跡，使用眼科剪剪去大網(wǎng)膜組織上肉眼可見的血管和纖維，盡量減少血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的污染，用眼科鑷將0.5～1 cm3大小的脂肪顆粒夾入50 mL離心管，加入兩倍體積的Ⅰ型膠原酶溶液（濃度2 mg/mL），移至培養(yǎng)箱，消化30 min。消化組織后，向膠原酶溶液中加入含血清的培養(yǎng)液2 mL終止消化，獲得組織消化液，經(jīng)100μm細胞過濾器，過濾掉油脂、未消化的纖維組織和成熟脂肪細胞，獲得脂肪基質(zhì)細胞懸液，移入15 mL離心管，1 500 r/min速度離心5 min。見管底細胞沉淀，輕輕吸去上清。再加入1 mL的PBS，再次同樣轉(zhuǎn)速離心。見管底細胞沉淀，輕輕吸去上清。向細胞沉淀加入1 mL完全培養(yǎng)液，吹打混勻，移入25 cm2培養(yǎng)瓶，加完全培養(yǎng)液至6 mL，移至培養(yǎng)箱。獲得的脂肪基質(zhì)細胞中混有多種細胞，包括具有多能分化潛能的脂肪干細胞、成熟脂肪細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等，因此每日觀察細胞貼壁情況，第3天有部分細胞已經(jīng)貼壁，可以進行半量換液，即吸出舊培養(yǎng)液3 mL，加入新鮮培養(yǎng)液3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，等待7 d左右，貼壁細胞更多，可以再次換液，換6 mL新鮮培養(yǎng)液。b.傳代：原代細胞經(jīng)過貼壁生長，10 d左右，單層細胞覆蓋70%～80%瓶壁，吸除培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入2 mL的PBS漂洗。加入1 mL胰蛋白酶，顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細胞間隙增大，用移液槍吹打平底細胞，獲得細胞懸液，此時加入完全培養(yǎng)液2 mL終止消化。將細胞懸浮液移入15 mL離心管，1 000 r/min速度離心5 min。見管底細胞沉淀，輕輕吸去上清。再加入1 mL PBS，吹打混勻，1 000 r/min速度離心5 min。見管底細胞沉淀，輕輕吸去上清。向細胞沉淀加入1 mL完全培養(yǎng)液，吹打混勻，移入細胞培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液至6 mL，移至培養(yǎng)箱，等待24 h后，細胞貼壁。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，另將500 mL搪瓷杯中注入蒸餾水，放置在電加熱套上，加熱至水溫37℃；從液氮罐中迅速取出凍存管，放入已加熱的蒸餾水中；等待1 min，凍存管中的細胞懸液融化；凍存管放入上海安亭TDL-5-A離心機，1 000 r/min速度離心5 min；從離心機中取出凍存管，外噴75%酒精后，滅菌紗布擦拭凍存管，置于超凈臺上；用移液槍小心吸除凍存管上層液體，留下下層細胞沉淀；再向凍存管中加入1 mL細胞培養(yǎng)基，吹打成細胞懸液；移液槍吸取細胞懸液移入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，再加入5 mL細胞培養(yǎng)基；將細胞培養(yǎng)瓶放入細胞培養(yǎng)箱；24 h后予以換液；72 h后3T3-L1密布于培養(yǎng)瓶底，予以傳代。

1.5 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1增殖曲線繪制 ①人網(wǎng)膜脂肪干細胞：取培養(yǎng)成功的第2代人網(wǎng)膜脂肪干細胞，制成細胞懸液，按4×104/孔接種于96孔板，設(shè)3個復(fù)孔為一組，共10組，每天測一組細胞的吸光值。24 h后細胞貼壁，選擇第一組細胞，每孔換新鮮培養(yǎng)基100μL、加10μL的CCK-8溶液（四唑鹽溶液），另設(shè)3個無細胞對照孔，加等體積的培養(yǎng)液和CCK-8溶液；其余暫未測定的細胞，也需每日換液，每孔100μL培養(yǎng)基。37℃孵育2 h，其中四唑鹽被細胞線粒體的脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜，可以直接測定吸光值。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，制成細胞懸液，按4×104/孔接種于96孔板，復(fù)孔和組數(shù)的設(shè)置、每孔加入的新鮮培養(yǎng)基、CCK-8溶液均與人網(wǎng)膜脂肪干細胞的處理方法相同。每日測定兩種細胞及無細胞對照孔的吸光度值。選擇波長450 nm，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值。以時間（天）為橫軸，吸光值為縱軸繪制生長曲線。

1.6 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1油紅O染色 ①人網(wǎng)膜脂肪干細胞：取生長良好的第2代人網(wǎng)膜脂肪干細胞，用胰蛋白酶消化后，細胞計數(shù)板下計數(shù)，按1×105個/孔接種接種入6孔板，24 h后細胞貼壁，更換為分化培養(yǎng)液（2 mL/孔），每2 d換液1次，每天觀察轉(zhuǎn)化情況，至第10天，誘導(dǎo)成熟，進行油紅O染色。移除細胞培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，加油紅O固定液固定20～30 min。棄去固定液，用蒸餾水洗2次。加入60%異丙醇浸洗5 min，棄去60%異丙醇后加入新配制好的油紅O染液，浸染10～20 min。棄去染色液，水洗2～5次，直到無多余染液。加入蘇木素染色液，復(fù)染核1 min。棄去染液后水洗2～5次。加入油紅O緩沖液1 min，棄去。加入蒸餾水1 mL覆蓋細胞并在顯微鏡下觀察。②3T3-L1：復(fù)蘇凍存的3T3-L1，制成細胞懸液，按1×105/孔接種于6孔板，24 h后細胞貼壁，更換為分化培養(yǎng)液（2 mL/孔），每2 d換液1次，每天觀察轉(zhuǎn)化情況，至第10 d，誘導(dǎo)成熟，進行油紅O染色。油紅O染色步驟與人網(wǎng)膜脂肪干細胞的處理方法相同。

2 結(jié)果

2.1 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1生長情況比較 ①人網(wǎng)膜脂肪組織消化液經(jīng)離心后，獲得1×105～2×105個細胞，接種入25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，貼壁時間為48～72 h，經(jīng)過貼壁篩選和換液，貼壁細胞以脂肪干細胞為主，呈片增殖（圖1A），再經(jīng)過48 h，顯微鏡下觀察貼壁細胞為圓形、類圓形、梭形、多角形（圖1B），生長良好的細胞可以覆蓋細胞培養(yǎng)瓶面積的80%，此時傳代。第1代細胞24 h之內(nèi)貼壁，細胞形態(tài)多為梭形、多角形（圖1C），培養(yǎng)4 d后細胞覆蓋培養(yǎng)瓶70%～80%，再次傳代比例為1︰1或者1︰2，即1瓶細胞消化脫壁后，制成細胞懸液，分裝入1瓶或者2瓶。第2代、第3代和1代倍增時間相似。細胞傳至第4代時，細胞增殖緩慢，貼壁生長4天細胞形態(tài)出現(xiàn)老化，細胞形態(tài)扁平，細胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多（圖1D）。②凍存的3T3-L1復(fù)蘇24 h貼壁，細胞形態(tài)為多角形（圖1E），48 h增殖的細胞排列更為緊密，覆蓋培養(yǎng)瓶底90%以上（圖1F），72 h可以傳代。

2.2 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1增殖曲線比較 ①人網(wǎng)膜脂肪干細胞第3代接種第1天，吸光值略升高，說明細胞緩慢生長；第2～5天吸光值逐漸升高，為指數(shù)增長期；第6～8天吸光值在3.2左右，為平臺期；第9天吸光值迅速下降，細胞開始衰亡。②3T3-L1接種后48 h，吸光值升高曲線如指數(shù)函數(shù)，細胞倍增時間為48 h，第3天進入平臺期，吸光值在3.2～3.6，詳見圖2。

2.3 人網(wǎng)膜脂肪干細胞、3T3-L1分化后油紅染色比較 經(jīng)過10天誘導(dǎo)分化，人網(wǎng)膜脂肪干細胞與3T3-L1脂肪細胞中均出現(xiàn)串珠狀小脂滴、有的細胞中為大脂滴，用油紅O染色，脂滴被染成紅色，約80%的細胞可見比較密集的紅染的脂滴（圖3A、B）。在10天誘導(dǎo)過程中，兩種貼壁的脂肪干細胞出現(xiàn)漂浮、凋亡，人網(wǎng)膜脂肪干細胞凋亡較明顯。

3 討論

隨著肥胖的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)臟脂肪體積增加同時伴隨分泌功能異常，導(dǎo)致機體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增加、發(fā)生胰島素抵抗。內(nèi)臟脂肪細胞功能的研究是目前很多代謝性疾病研究熱點。3T3-L1及其亞克隆系源自瑞士Swiss鼠的胚胎干細胞，具有多向分化功能，是目前最常使用的脂肪細胞模型，但3T3-L1分化為成熟脂肪細胞后，代謝特點不能完全模擬人內(nèi)臟脂肪細胞。人的脂肪干細胞來源不同，功能也不同。內(nèi)臟與皮下的脂肪干細胞比較，內(nèi)臟脂肪干細胞分泌更多的腫瘤壞死因子α、白介素6、單核細胞趨化蛋白等炎癥因子［7］，可誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生。從內(nèi)臟脂肪組織提取前脂肪細胞，將前脂肪細胞誘導(dǎo)為成熟脂肪細胞［8］，是研究代謝性疾病的最佳細胞模型。

圖3 誘導(dǎo)成功的人網(wǎng)膜脂肪細胞和3T3-L1脂肪細胞油紅O染色

本實驗成功從人網(wǎng)膜脂肪組織提取脂肪干細胞、并誘導(dǎo)為成熟脂肪細胞，原代細胞的貼壁生長時間、傳代次數(shù)與盛志峰等［8］的研究基本一致。但提取的脂肪干細胞數(shù)目、脂肪干細胞培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化液成分、成脂誘導(dǎo)時間各個文獻中差別較大。脂肪組織消化液中的細胞數(shù)目越多，原代培養(yǎng)成功率越高，有文獻報道需要大網(wǎng)膜脂肪組織質(zhì)量為10～40 g［9-10］，但獲取人體網(wǎng)膜脂肪組織存在一定風(fēng)險。本研究顯示，0.5 g網(wǎng)膜組織可提取原代細胞數(shù)目可達1×105以上。Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織中的膠原纖維，加速脂肪細胞的解離。既往研究顯示，膠原酶消化時間1～1.5 h［11］，為了減少膠原酶對細胞的傷害，本研究控制消化時間為30 min為宜。

李彩霞等［12］使用超高相質(zhì)譜—色譜技術(shù)分析胎牛血清的成分，發(fā)現(xiàn)其中含有促進細胞黏附、增殖、分化的細胞因子。本實驗使用細胞培養(yǎng)基含有體積分數(shù)10%的胎牛血清，原代細胞和4代之內(nèi)的細胞貼壁和增殖良好，因此脂肪干細胞培養(yǎng)基中加入胎牛血清，可以促進細胞貼壁生長。但傳至4代的細胞較早出現(xiàn)老化形態(tài)，增殖緩慢。而KOCAOEMER等［13］使用胎牛血清替代物培養(yǎng)人脂肪干細胞，傳至3～4代，細胞增殖速度明顯高于胎牛血清培養(yǎng)組，并且細胞形態(tài)正常，未見老化細胞。盡管胎牛血清是脂肪干細胞最常用的培養(yǎng)基補充劑，但是由于異種血清中病原微生物和抗原對人類脂肪干細胞的免疫刺激，加速干細胞凋亡，更多的研究者使用胎牛血清替代品培養(yǎng)增殖力旺盛的脂肪干細胞［14］。本實驗在誘導(dǎo)脂肪干細胞過程中，加入分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，每天拍照觀察，第3～4天脂肪干細胞由梭形變?yōu)轭悎A形，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)串珠樣小脂滴，但此時每天使用基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基，細胞質(zhì)內(nèi)的脂滴逐漸消失，所以為了使得干細胞持續(xù)分化，積累脂滴，本實驗每2天更換新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，維持10 d，取得良好效果。在10天誘導(dǎo)過程中，部分細胞脫壁漂浮，降低了成熟脂肪細胞產(chǎn)量，分析其原因可能為異種血清中細胞因子干擾脂肪干細胞分化的信號通路、有機溶劑乙醇的細胞毒性。有研究［15］使用無血清成脂誘導(dǎo)方法，減少肽牛血清中異種抗原對干細胞的免疫刺激。無血清誘導(dǎo)分化液中除了細胞生長必須的營養(yǎng)素和細胞成脂分化必須的胰島素、地塞米松和IBMX，還有抗氧化物質(zhì)；有研究發(fā)現(xiàn)明膠和脂肪干細胞共培養(yǎng)可以更好的保持細胞活性［16］，VOLZ等［17］使用Ⅰ型膠原覆蓋細胞培養(yǎng)板，然后接種脂肪干細胞進行誘導(dǎo)分化，可以顯著增加細胞黏附和活性。

總之，人網(wǎng)膜脂肪干細胞具有分化為成熟脂肪細胞的能力，但增殖能力有限。隨著體外培養(yǎng)技術(shù)的改良，人網(wǎng)膜脂肪干細胞將有更廣闊的應(yīng)用前景。