李文強 劉慧穎 任衛(wèi)東

1河北北方學院研究生學院（河北張家口 075000）；2河北北方學院附屬第一醫(yī)院內分泌科（河北張家口 075000）

甲狀腺癌是內分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，總體上治療效果良好，但仍有一部分難治性甲狀腺癌缺乏有效的治療手段，提高其診斷及治療效率是關鍵。靶向治療是一種新型的治療技術，研究甲狀腺癌的發(fā)病機制，利用相關分子作為靶點，進而研發(fā)靶向藥物進行治療，能夠為甲狀腺癌患者帶來新的希望［1-3］。研究發(fā)現越來越多的非編碼RNA（ncRNA）在人類甲狀腺癌中顯示出異常表達，miRNA、circRNA等不同RNA分子參與調節(jié)甲狀腺癌的發(fā)生與進展過程，有望作為靶向治療的分子靶點［4-6］。circ_0023642是來源于紫外線抵抗相關基因（ultraviolet resistanceassociated gene，UVRAG）的 circRNA，位于染色體chr11：75727858-75728024，研究報道雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）可通過降低circ_0023642抑制膀胱癌細胞的侵襲［7］。hsa_circ_0023642在胃癌中被上調，且與胃癌的惡性程度呈高度正相關；沉默circ_0023642顯著降低了胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移［8］。circ_0023642可通過調控miR-508-3p促進胃癌GMC-803細胞增殖和轉移的惡性生物學行為［9］。然而circ_0023642對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響及機制尚不清楚。生物學軟件預測發(fā)現circ_0023642與miR-653有結合位點。研究報道m(xù)iR-653-5p過表達可抑制黑色素瘤細胞生長［10］。hsa_circ_0004771的沉默可通過激活miR-653來抑制乳腺癌的增殖并誘導其凋亡［11］。而miR-653對甲狀腺癌細胞生物學行為的影響及circ_0023642是否調控miR-653也尚不清楚。本實驗旨在研究circ_0023642是否通過調控miR-653影響甲狀腺癌的細胞生物學行為，為甲狀腺癌靶向治療提供理論指導及可能的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取本院25例甲狀腺癌患者的癌組織及相應的癌旁組織，男16例，女9例；年齡29～78歲，平均年齡（64.6±4.4）歲，其中乳頭狀癌14例，濾泡癌3例，髓樣癌3例，未分化癌5例。所有患者經病理檢測確診為甲狀腺癌，具有完整臨床病理資料，所有患者均知情且同意。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 細胞與主要試劑 甲狀腺癌細胞SW579購自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基產自美國（由Gibco公司生產）；熒光定量試劑盒購自國內（由上?？泼羯锟萍加邢薰局圃欤凰募谆嫉螓}比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT）試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；凋亡檢測試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；吉姆薩染色液、蛋白提取試劑盒統(tǒng)一采購于國內，均由北京百奧萊博科技有限公司生產；試驗使用的Transwell小室和Matrigel均購自美國，由BD公司生產；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒由南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 細胞處理與分組 取對數生長期甲狀腺癌細胞 SW579，將 si-NC、si-Hsa_circ_0023642、miRNC、miR-653轉染至SW579細胞中，記為si-NC組、si-Hsa_circ_0023642組、miR-NC組、miR-653組；將si-Hsa_circ_0023642分別與anti-miR-NC、anti-miR-653共轉染至SW579細胞中，記為si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組、si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653組。

1.3.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測Hsa_circ_0023642和miR-653的表達水平 將組織和細胞的總RNA分離出來，用以合成cDNA，根據熒光定量試劑盒的要求進行PCR操作，其循環(huán)的條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共進行40個循環(huán)；使用2-△△Ct法計算相對表達量。GAPDH和U6分別用作Hsa_circ_0023642和miR-653的內參，Hsa_circ_0023642上游引物序列：5′-ATGACAAACTGACGGAAAAGGAG-3′，下游引物序列：5′-AACCAAGGGCAACAGCAATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；miR-653上游引物序列：5′-ACCAGCTTCAAACAAGTTCACTG-3′，下游引物序列：5′-GCTTCCATCTTATCATTCTTGCA-3′；U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；該引物購自國內上海生工生物工程公司。

1.3.3 MTT檢測細胞增殖 培養(yǎng)48 h后，在各孔中注入20 μL MTT溶液并孵育4 h，然后添加二甲基亞砜并進行震蕩反應，用量為150 μL，震蕩時間為10 min，需使用酶標儀在波長490 nm處測量吸光度（OD）值。

1.3.4 克隆形成實驗檢測集落形成數 使用SW579細胞制作細胞懸液，濃度為1×104個/mL，然后在六孔板中接種，進行為期2周的培養(yǎng)，當出現肉眼可見克隆時停止培養(yǎng)，使用PBS清洗，共2次，使用甲醇固定，持續(xù)15 min，使用吉姆薩法染色，持續(xù)30 min，最后采用低倍光學顯微鏡對計數＞50個細胞的集落進行計數。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 對細胞進行為期48 h的培養(yǎng)，PBS漂洗，添加500 μL結合緩沖液，隨后分別置入Annexin V-FITC和PI溶液中混合，Annexin V-FITC和PI溶液的用量分別為10 μL和5 μL，孵育10 min，孵育期間避免陽光照射。統(tǒng)計細胞凋亡率，統(tǒng)計設備為流式細胞檢測儀。

1.3.6 蛋白質印跡（Western blot）法檢測蛋白表達 提取細胞總蛋白（參考蛋白提取試劑盒說明書執(zhí)行），將其中50 μL的蛋白樣品進行SDS-PAGE，然后轉移至PVDF膜上，使用5%牛血清蛋白對其進行封閉處理，時長為60 min；然后添加一抗在4℃條件下放置一夜，添加二抗在室溫條件下放置1 h，加入化學發(fā)光試劑使其顯影，研究分析其成像的蛋白條帶灰度值，依據的公式為蛋白表達水平=目的條帶/GAPDH條帶。

1.3.7 細胞劃痕實驗檢測劃痕愈合率 各組細胞消化后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在盤底用記號筆劃線做標記，細胞鋪滿后用槍頭垂直橫線劃痕，用PBS沖洗劃下的細胞，換液繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和24 h后觀察，用Image-Pro Plus6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.3.8 Transwell檢測細胞侵襲數 將100 μL稀釋后的Matrigel添加到Transwell上室中，并充分混合，凝固后加入100 μL細胞懸液，下室加500 μL含血清培養(yǎng)液，培育24 h，結晶紫染色30 min，使用光學顯微鏡隨機抓取5個視野觀察觀察細胞計數，倍數為200倍。

1.3.9 雙熒光素酶報告實驗 構建Hsa_circ_0023642的野生型和突變型熒光素酶載體wt-Hsa_circ_0023642和mut-Hsa_circ_0023642，然后和miR-NC、miR-653共同轉染至SW579細胞，熒光素酶的活性依照說明書的要求進行。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0軟件處理實驗數據，滿足正態(tài)分布的計量資料，采用均數±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hsa_circ_0023642和miR-653在甲狀腺癌細胞中的表達 甲狀腺癌組織中Hsa_circ_0023642的表達水平具有上升趨勢，明顯高于健康組織，而miR-653的表達水平則呈現出下降趨勢（P＜0.05），見圖1。

圖1 Hsa_circ_0023642和miR-653的表達Fig.1 Expression of Hsa_circ_0023642 and miR-653

2.2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡的影響 si-Hsa_circ_0023642組的Hsa_circ_0023642水平明顯低于si-NC組，但miR-653、細胞凋亡率和Bax表達情況均呈上升趨勢，細胞活性、集落形成數以及Bcl-2表達水平呈下降趨勢（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡的影響Tab.1 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on the proliferation and apoptosis of thyroid cancer cells ±s

表1 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡的影響Tab.1 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on the proliferation and apoptosis of thyroid cancer cells ±s

注：與si-NC組相比，aP＜0.05

分組si-NC si-Hsa_circ_0023642 t值P值Hsa_circ_0023642 1.00±0.00 0.21±0.02a 18.187＜0.001 miR-653 1.00±0.00 3.70±0.14a 33.404＜0.001 OD值1.27±0.09 0.58±0.05a 11.608＜0.001集落形成數（個）101.67±3.30 54.00±1.63a 22.433＜0.001凋亡率（%）8.22±0.53 21.97±1.15a 18.808＜0.001 Bax 0.13±0.01 0.63±0.05a 16.984＜0.001 Bcl-2 0.81±0.06 0.25±0.02a 15.336＜0.001

圖2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.2 The effect of interference with Hsa_circ_0023642 on apoptosis and the expression of Bax and Bcl-2 proteins in thyroid cancer cells

2.3 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-Hsa_circ_0023642組細胞劃痕愈合率降低，侵襲細胞數減少（P＜0.05），見表2。

表2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞遷移侵襲的影響Tab.2 The influence of interference with Hsa_circ_0023642 on the migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表2 干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞遷移侵襲的影響Tab.2 The influence of interference with Hsa_circ_0023642 on the migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與si-NC組相比，aP＜0.05

分組si-NC si-Hsa_circ_0023642 t值P值劃痕愈合率（%）55.70±2.34 34.18±1.60a 13.155＜0.001侵襲細胞數（個）149.00±5.35 79.00±2.94a 19.861＜0.001

2.4 Hsa_circ_0023642和miR-653靶向關系 Hsa_circ_0023642與miR-653有互補序列（圖3）；wt-Hsa_circ_0023642與miR-653轉染的細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而mut-Hsa_circ_0023642與miR-653轉染的細胞熒光素酶活性無明顯變化（表3）。

表3 雙熒光素酶報告實驗Tab.3 Double luciferase report experiment ±s

表3 雙熒光素酶報告實驗Tab.3 Double luciferase report experiment ±s

注：與miR-NC組相比，bP＜0.05

分組miR-NC miR-653 t值P值wt-Hsa_circ_0023642 0.96±0.08 0.18±0.02b 16.383＜0.001 mut-Hsa_circ_0023642 1.00±0.08 0.96±0.06 0.693 0.527

圖3 Hsa_circ_0023642和miR-653互補序列Fig.3 Complementary sequences of Hsa_circ_0023642 and miR-653

2.5 miR-653對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響 miR-653組的miR-653水平明顯高于miRNC組，細胞活性、集落形成數、細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數和Bcl-2表達水平呈下降趨勢，細胞凋亡率和Bax表達水平呈上升趨勢（P＜0.05），見圖4、表4。

表4 miR-653對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.4 The effect of miR-653 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表4 miR-653對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.4 The effect of miR-653 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與miR-NC組相比，bP＜0.05

分組miR-NC miR-653 t值P值miR-653 1.00±0.00 5.09±0.16b 44.276＜0.001 OD值1.29±0.12 0.52±0.03b 10.782＜0.001集落形成數（個）101.67±4.50 46.33±1.25b 20.523＜0.001凋亡率（%）8.23±0.54 23.99±1.20b 20.744＜0.001劃痕愈合率（%）56.33±2.31 31.53±1.73b 14.884＜0.001侵襲細胞數（個）150.00±6.38 65.67±2.62b 21.178＜0.001 Bax 0.13±0.01 0.83±0.06b 19.932＜0.001 Bcl-2 0.82±0.08 0.17±0.02b 13.653＜0.001

圖4 miR-653對甲狀腺癌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 The effect of miR-653 on the apoptosis of thyroid cancer cells and the expression of Bax and Bcl-2 proteins

2.6 抑制miR-653可逆轉干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響 si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653組的miR-653水平明顯低于si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組，同時細胞活性、集落形成數、細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數和Bcl-2均呈上升趨勢，細胞凋亡率和Bax表達情況呈下降趨勢（P＜0.05），見圖5、表5。

表5 抑制miR-653可逆轉干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

表5 抑制miR-653可逆轉干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖凋亡遷移侵襲的影響Tab.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the proliferation，apoptosis，migration and invasion of thyroid cancer cells ±s

注：與si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC組相比，cP＜0.05

分組si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-NC si-Hsa_circ_0023642+anti-miR-653 t值P值miR-653 3.71±0.13 1.50±0.06c 26.735＜0.001 OD值0.57±0.05 1.16±0.08c 10.832＜0.001集落形成數（個）55.33±1.25 89.00±3.27c 16.659＜0.001凋亡率（%）21.92±1.16 13.11±0.69c 24.139＜0.001劃痕愈合率（%）34.13±1.80 51.43±2.49c 9.753 0.001侵襲細胞數（個）77.67±2.49 129.33±4.19c 18.358＜0.001 Bax 0.64±0.05 0.26±0.02c 12.222＜0.001 Bcl-2 0.24±0.02 0.69±0.05c 14.474＜0.001

圖5 抑制miR-653可逆轉干擾Hsa_circ_0023642對甲狀腺癌細胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5 Inhibition of miR-653 can reverse the effect of interference Hsa_circ_0023642 on the apoptosis of thyroid cancer cells and the expression of Bax and Bcl-2 proteins

3 討論

隨著對腫瘤生物學和癌癥遺傳學的認識，新型靶向療法已用于甲狀腺癌的治療；了解甲狀腺癌的分子機制，開發(fā)用于治療甲狀腺癌的靶向藥物具有重要意義［12-14］。已有研究表明多種circRNA參與甲狀腺癌的惡性生物學行為，如circ_0058124、circ_102171、circ-ABCB10可影響甲狀腺癌細胞的增殖及侵襲［15-17］。有研究報道circ_0023642可促使胃癌細胞進行移動與侵襲［18］。而circ_0023642對甲狀腺癌細胞的影響尚不清楚。本實驗先檢測了甲狀腺癌組織中circ_0023642的表達水平，結果顯示，甲狀腺癌組織中circ_0023642的表達水平高于癌旁組織，表明circ_0023642可能在甲狀腺癌中起促癌作用，這是circ_0023642在甲狀腺癌中首次研究報道。為進一步研究circ_0023642對甲狀腺癌細胞的惡性生物學行為的影響，本研究干擾circ_0023642，結果顯示，細胞活性及劃痕愈合率呈下降趨勢，集落形成數及侵襲細胞數減少，而細胞凋亡率呈上升趨勢；表明干擾circ_0023642抑制了甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進了細胞凋亡。提示circ_0023642或可作為甲狀腺癌靶向治療的分子靶點。

研究表明，circRNA可通過microRNA調節(jié)基因翻譯和轉錄，進而影響一系列生物學過程［19］。因此，本實驗通過生物學軟件預測circ_0023642可能作用的下游miRNA，結果顯示circ_0023642與miR-653有結合位點。研究報道m(xù)iR-653可抑制非小細胞肺癌細胞的惡性生物學行為［20］。lncRNA PLK1S1通過調節(jié)miR-653促進了腎細胞癌細胞的增殖、侵襲和索拉非尼耐藥［21］。ciRs-6以通過使miR-653海綿化抑制膀胱癌的生長［22］。說明miR-653可參與調控多種腫瘤的進展，且受circRNA的調控。本實驗結果顯示，甲狀腺癌組織中miR-653表達水平降低；表明miR-653可能參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，且可能起抑癌基因作用。過表達miR-653后，細胞活性、集落形成數、細胞劃痕愈合率以及侵襲細胞數均呈下降趨勢，而細胞凋亡率呈上升趨勢；說明過表達miR-653可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、集落形成及遷移侵襲，并促進細胞凋亡。本研究結果也表明circ_0023642可對miR-653進行靶向調控；并且抑制miR-653可逆轉干擾circ_0023642對甲狀腺癌細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的影響，表明circ_0023642可能通過調控miR-653影響甲狀腺癌的進展。miR-653也可作為甲狀腺癌靶向治療的分子靶點。

綜上所述，干擾Hsa_circ_0023642可通過調控miR-653抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進細胞凋亡。circ_0023642及miR-653均影響甲狀腺癌進展，均可作為甲狀腺癌可能的分子標志物及分子治療的靶點。本實驗的新穎之處在于發(fā)現了circ_0023642和miR-653在甲狀腺癌中的可能作用。但本實驗主要是在體外細胞中進行，尚未在體內進行驗證，下一步會繼續(xù)在體內進行驗證。