朱園 劉秀丹 朱志剛 李康保 鐘偉杰

廣州市第一人民醫(yī)院1老年病科血液腫瘤科，2超聲醫(yī)學科，3老年病科消化科（廣州 510180）

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型，約占25%～35%［1］，在我國占比更高，可達45%［2］。雖然一線的免疫化療R-CHOP方案改善了DLBCL患者的預后，但仍有相當一部分患者因利妥昔單抗耐藥而出現(xiàn)進展或復發(fā)，有研究報道［3］，30%的DLBCL病例對利妥昔單抗耐藥，既往對利妥昔單抗治療敏感的B細胞淋巴瘤病人再次接受治療時，接近60%的病例出現(xiàn)利妥昔單抗耐藥［4］。

腫瘤微環(huán)境中包含有輔助性17細胞（Th17）和調節(jié)性T細胞（Treg），Th17細胞主要分泌白細胞介素（IL）-17起作用。新的CD4+T細胞亞型IL-17+Foxp3+Treg細胞（IFT）為Treg和Th17細胞分化的中間階段細胞，也可以分泌IL-17。研究發(fā)現(xiàn)［5-6］IFT促進食管癌和結腸癌生長。IL-17是DLBCL發(fā)生發(fā)展中的關鍵因素，并與預后相關。IL-17在體內及體外均促進DLBCL的生長［7］。利妥昔單抗使DLBCL細胞分泌IL-6增加，促進Th17和IFT細胞表達增加并分泌IL-17增加，抑制了p53的表達，誘導DLBCL細胞抵抗利妥昔單抗［8］。

華蟾素（cinobufagin）的主要成分是干蟾皮提取物，所含的蟾蜍苷元及華蟾蜍精具有較強的抗癌作用［9］。華蟾素可增強惡性淋巴瘤的化療效果［10］。華蟾素可抑制消化道腫瘤患者Treg細胞的數量［11］，降低肺癌患者外周血中IL-17等Th17細胞相關細胞因子的表達［12］。華蟾素還可調控肺癌患者Th17和Treg細胞及IL-17的表達［9］。上述研究均局限于外周血，而目前尚無華蟾素對DLBCL腫瘤微環(huán)境中Th17和Treg細胞的研究。

本研究通過體外細胞共培養(yǎng)，構建模擬的DLBCL腫瘤微環(huán)境，通過ELISA、qRT-PCR、流式細胞術和細胞凋亡檢測等方法，探討華蟾素能否改善IL-17A引起的DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥，并初步分析其中的機制。本研究首次在體外實驗中證實華蟾素能逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞 CCK-8試劑盒購買自日本Dojindo公司，Transwell小室購買自美國CORNING公司，重組人IL-17A購買自美國R&D Systems公司，利妥昔單抗（rituximab，0.1 g/100 mL）購買自瑞士諾華公司，華蟾素（5 mL/支）購買自安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司。所有ELISA試劑盒、流式抗體和凋亡試劑盒均購買自美國eBioscience公司，western blot抗體均購買自美國Santa Cruz公司。人體外周血單個核細胞（PBMCs）是通過空腹抽取健康志愿者的外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque方法分離獲得。人DLBCL細胞株SU-DHL-2（ABC型）和SU-DHL-4細胞株（GCB型）購買自BNCC（北京，中國）。本研究方案獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審查通過，倫理批件號為K-2019-034-01。

1.2 體外細胞共培養(yǎng) 本項目包含兩個體外細胞共培養(yǎng)實驗，分別培養(yǎng)72 h。SU-DHL-2/4細胞和PBMCs的細胞濃度均為1×106個/孔，IL-17A濃度為0.1 ng/mL，利妥昔單抗?jié)舛葹?0 μg/mL，華蟾素用量為注射液原液0.2 mL。分組具體如下：實驗一：分成2大組，各6小組，分組如下：SU-DHL-2單獨；SU-DHL-2+華蟾素；SU-DHL-2+利妥昔單抗；SU-DHL-2+利妥昔單抗+華蟾素；SU-DHL-2+利妥昔單抗+IL-17A；SU-DHL-2+利妥昔單抗+IL-17A+華蟾素；SU-DHL-4單獨；SU-DHL-4+華蟾素；SU-DHL-4+利妥昔單抗；SU-DHL-4+利妥昔單抗+華蟾素；SU-DHL-4+利妥昔單抗+IL-17A；SU-DHL-4+利妥昔單抗+IL-17A+華蟾素。實驗二：將SU-DHL-2/4細胞、PBMCs按1∶1的比例共培養(yǎng)，并使用Transwell小室間接培養(yǎng)，加或不加華蟾素，其中SUDHL-2或SU-DHL-4細胞置于小室中，其他細胞置于小室外。分組如下：PBMCs+SU-DHL-2；PBMCs+SU-DHL-2+華蟾素；PBMCs+SU-DHL-4；PBMCs+SUDHL-4+華蟾素。

1.3 Western blot 本研究使用western blot檢測各組SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞中cleaved PARP、cleaved caspase-3和GAPDH蛋白的表達，步驟與方法同文獻［13］。

1.4 流式細胞術 調整細胞密度為2×106個/mL。Th17細胞檢測：在37℃和5%CO2條件下，在培養(yǎng)基中加入50 ng/mL的佛波酯、10 μg/mL的Brefeldin A和1 μg/mL的離子霉素，刺激細胞5 h。然后用抗CD3-FITC、抗CD8-PE和抗IL-17A-APC抗體在室溫下對細胞進行染色1 h。Treg細胞檢測：在室溫下用抗CD25-PE-Cy7、抗CD4-FITC、抗Foxp3-PE和IL-17A-APC抗體進行染色1 h。然后上機分析，使用Flowjo 10軟件分析數據。CD3+CD8-IL-17A+細胞定義為Th17細胞，CD4+CD25+Foxp3+IL-17A+細胞定義為IFT細胞。

1.5 CCK-8、ELISA和細胞凋亡測定 步驟與方法同文獻［13］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0進行分析。計量資料以均數±標準差表示。采用Two-tailed independent-sample Student′s t/t檢驗對兩組之間進行比較。單因素方差分析和Bonferroni檢驗（每兩組之間）用于多組之間的比較。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 華蟾素逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥 前期已經證實IL-17A可引起DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥［8］，本研究旨在探索華蟾素能否逆轉IL-17A引起的耐藥。見圖1，華蟾素并不能直接抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞的增殖（SU-DHL-2：P ＞ 0.99；SU-DHL-4：P ＞0.99）；利妥昔單抗可顯著抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞的增殖（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而IL-17A明顯減弱了利妥昔單抗抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞增殖的作用，引起耐藥（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；最后，華蟾素逆轉IL-17A引起的SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞對利妥昔單抗的耐藥（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）。

圖1 華蟾素逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥Fig.1 Cinobufagin reversed the rituximab resistance of DLBCL cell lines induced by IL-17A

2.2 華蟾素逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株凋亡率減少 為了進一步探討華蟾素逆轉IL-17A引起DLBCL細胞株對利妥昔單抗耐藥的機制，筆者檢測了華蟾素對DLBCL細胞株凋亡的影響。圖2A為不同分組中SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞的具有代表性的凋亡流式圖。如圖2B-C所示，利妥昔單抗顯著增加了SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而IL-17A加入后，顯著抑制了利妥昔單抗誘發(fā)的SUDHL-2或SU-DHL-4細胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）；而華蟾素又逆轉了IL-17A這一作用，增加了SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞的凋亡率（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P＜0.01）。這些結果表明華蟾素是通過增加DLBCL細胞株的凋亡來改善IL-17A引起的對利妥昔單抗的耐藥。

圖2 華蟾素逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株凋亡率減少Fig.2 Cinobufagin reversed the reduced apoptosis rate of DLBCL cell lines induced by IL-17A

2.3 華蟾素通過升高Cleaved PARP和Cleaved caspase-3的表達促進DLBCL細胞株的凋亡 進一步檢測華蟾素對DLBCL細胞株中常見凋亡信號通路中的常見蛋白的影響。收集各組中的SUDHL-2或SU-DHL-4細胞，使用Western blot法檢測cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平。圖3結果顯示，與對照組相比，華蟾素組輕微升高了DLBCL細胞株內cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平，且華蟾素+IL-17A+利妥昔單抗組比IL-17A+利妥昔單抗組DLBCL細胞株內的cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白水平顯著升高。這些結果提示，華蟾素可能通過升高cleaved PARP和cleaved caspase-3表達促進DLBCL細胞株的凋亡。

圖3 華蟾素通過升高SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞中cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達Fig.3 Cinobufagin increased the expressions of cleaved PARP and cleaved caspase-3 in SU-DHL-2 and SU-DHL-4 cells

2.4 華蟾素抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化，降低IL-17A水平 除了直接影響DLBCL細胞株的凋亡以外，還進一步研究華蟾素對腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化及IL-17A水平的影響。見圖4B、D，華蟾素顯著抑制SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞微環(huán)境中 Th17（SU-DHL-2：P=0.011；SU-DHL-4：P=0.025）和IFT細胞（SU-DHL-2：P＜0.01；SU-DHL-4：P=0.017）的分化。而且，華蟾素也顯著減低SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞微環(huán)境中IL-17A的水平（SU-DHL-2：P＜0.01；SUDHL-4：P＜0.01）（圖4E），但對TGF-β和IL-10水平無影響（圖4F-G）。

圖4 華蟾素抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化，降低IL-17A水平Fig.4 Cinobufagin inhibited the differentiation of Th17 and IFT cells in tumor microenvironment，and then decreased the level of IL-17A

3 討論

初治DLBCL患者中有約40%最終會復發(fā)或進展，這些患者的3年無疾病進展生存率僅為37%，總生存率僅為49%，預后非常差，而獲得性的利妥昔單抗耐藥是其中的重要原因［14］。因此，探索并闡明利妥昔單抗耐藥的機制以及找到逆轉利妥昔單抗耐藥的藥物非常重要。導致利妥昔單抗耐藥的原因很多，主要包括以下三方面：CD20結構功能異常、補體和抗凋亡蛋白異常表達抑制利妥昔單抗作用和腫瘤微環(huán)境的改變等［15］。前期研究［8，16］證實利妥昔單抗可促進DLBCL腫瘤微環(huán)境中IL-17A水平升高，IL-17A導致DLBCL細胞株凋亡減少，引起利妥昔單抗耐藥。

本研究結果證實，外源性IL-17A在體外可構建DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥模型，而華蟾素通過：（1）升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達促進DLBCL細胞株的凋亡；（2）抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化降低IL-17A水平這兩方面作用，最終逆轉IL-17A引起的DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥。

IL-17A是IL-17家族6個成員（IL-17A-F）中之一，主要來源于Th17細胞，部分來源于IFT細胞，IL-17A是構成腫瘤微環(huán)境的重要成分之一［17］。IFT細胞是Treg和Th17細胞之間的一種中間形態(tài)，早已被證實能分泌IL-17A［18］。IL-17A已被多項研究證實能促進卵巢癌、結腸癌等腫瘤的化療或靶向藥物耐藥［19-20］。而且，前期研究［8，16］已經證實IL-17A可引起DLBCL對利妥昔單抗的耐藥。本研究中通過外源性IL-17A順利構建DLBCL細胞株對利妥昔單抗的耐藥模型，與之前的研究結論一致。因此，如何能降低腫瘤微環(huán)境中IL-17A水平或拮抗IL-17A作用成為改善DLBCL對利妥昔單抗耐藥的關鍵因素。

華蟾素是我國中藥瑰寶之一，是我國蟾蜍科動物中華大蟾蜍的全皮陰干后，經提取加工處理，制成的水溶性成分，主要成分包括蟾毒內酯類、吲哚生物堿類、多肽、膽固醇等［21］。華蟾素已被廣泛應用于肺癌、肝癌、乳腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤中，均取得明顯抑瘤作用［22］。相比于西醫(yī)藥物，華蟾素優(yōu)勢在于其具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、放化療增敏及逆轉耐藥等作用［22］。LIU等［23］發(fā)現(xiàn)華蟾素能逆轉鼻咽癌對順鉑藥物化療的耐藥性，王玲等［24］也發(fā)現(xiàn)華蟾素能逆轉人乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥。而且，華蟾素能降低肺癌患者外周血中IL-17等Th17細胞相關細胞因子的表達［12］，可調控肺癌患者Th17和Treg細胞及IL-17的表達［9］。cleaved PARP和cleaved caspase-3是細胞凋亡通路中的兩種重要蛋白，這兩者水平升高，提示細胞凋亡率增高［25］。ZHANG等［26］研究發(fā)現(xiàn)華蟾素能升高cleaved PARP和cleaved caspase-3蛋白的表達而促進葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡。與上述前期研究一致，本研究體外實驗證實華蟾素升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達促進DLBCL細胞株的凋亡，抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化降低IL-17A水平，最終逆轉IL-17A引起的DLBCL對利妥昔單抗的耐藥。這個結果進一步證實了華蟾素在逆轉化療耐藥上具有獨特的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究證實華蟾素在體外升高cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達促進DLBCL細胞株的凋亡，抑制腫瘤微環(huán)境中Th17和IFT細胞的分化降低IL-17A水平，最終逆轉IL-17A引起的DLBCL對利妥昔單抗的耐藥。未來希望能進一步在動物實驗或者人體試驗中證實華蟾素逆轉利妥昔單抗耐藥的作用，為未來臨床上應用華蟾素聯(lián)合傳統(tǒng)免疫化療藥物治療DLBCL患者提供更充實的證據。華蟾素未來有望成為DLBCL治療的聯(lián)合用藥之一。