謝竹夫 黃啟友 姚菲 周川人 黃曉穎 王強(qiáng) 吳清明

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院（武漢 430070）；2職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢 430070）；3武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院（武漢 430061）

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］，目前的治療手段包括外科手術(shù)、放療、化療以及靶向治療，對(duì)于中晚期或者轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌，以化療為主的治療方法是更好手段之一［2-3］，主要化療藥物是5-氟尿嘧啶（5-Fu）和順鉑（DDP），耐藥性問(wèn)題仍然是癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的首要原因［4-6］，目前關(guān)于結(jié)直腸癌耐藥的機(jī)制尚未明確，結(jié)直腸癌對(duì)化療藥物的耐藥涉及許多基因的變化，從中找出關(guān)鍵的耐藥基因是亟需解決的問(wèn)題。GTP酶Rab家族與腫瘤耐藥密切相關(guān)，有研究［7］表明，沉默Rab25的肺癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性增加，而在卵巢癌A2780細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Rab25可誘導(dǎo)對(duì)順鉑的耐藥性［8］，本研究利用構(gòu)建的結(jié)直腸癌耐藥株，試圖探討Rab25與結(jié)直腸癌化療耐藥之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-8購(gòu)自中國(guó)武漢細(xì)胞典藏中心，耐藥株由湖南豐暉生物科技有限公司對(duì)親本株誘導(dǎo)產(chǎn)生；5-Fu和DDP購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Rab25蛋白抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Rab25引物（Forward：GGT GGT GCT GAT CGG CGA ATC；Reverse：CAG TGC GGG TGG AGA ACT CAA C）由生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)及合成。人Rab25基因ORF克隆質(zhì)粒、pCMV3-C-FLAG空載和Sinofection轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Sino Biological公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株構(gòu)建 本研究采用大濃度藥物沖擊結(jié)合藥物濃度遞增法誘導(dǎo)構(gòu)建耐藥細(xì)胞株，5-Fu誘導(dǎo)藥物濃度分別為1、2、4、6、8、10 μg/mL，DDP 誘導(dǎo)藥物濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL。步驟如下：用含有胎牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基分別配制濃度為20 μg/mL的5-Fu溶液和2 μg/mL的DDP溶液，待結(jié)直腸癌親本株HCT-8生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再按上述濃度梯度增加DDP或5-Fu劑量。依此類推，直到細(xì)胞可以在10 μg/mL 5-Fu和1 μg/mL DDP中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代。將耐受DDP與5-Fu的HCT-8命名為HCT-8/DDP和HCT-8/5-Fu。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT-8結(jié)直腸癌細(xì)胞株使用含10%胎牛血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HCT-8結(jié)直腸癌細(xì)胞5-Fu和DDP耐藥株使用含有對(duì)應(yīng)的5-Fu或者DDP的10%胎牛血清培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以維持細(xì)胞耐藥性，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。

1.2.3 MTT比色法 待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，鋪96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（約5 000個(gè)細(xì)胞）；常規(guī)培養(yǎng)，次日加入0、5、10、15、25、50 μg/mL濃度的 DDP，5-Fu 為 0、5、10、20、40、80 μg/mL，HCT-8/DDP培養(yǎng) 24 h或 48 h，HCT-8/5-Fu培養(yǎng)48 h或72 h，加入MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，避光搖勻，放酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)490 nm。

1.2.4 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 全基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測(cè)序，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組基因測(cè)序比對(duì)結(jié)直腸癌正常株及耐藥株之間RNA水平差異，篩選與結(jié)直腸癌耐藥相關(guān)的GTPase Rab家族基因，測(cè)序?qū)嶒?yàn)步驟流程為：（1）RNA樣本純度、濃度檢測(cè)；（2）mRNA富集及反轉(zhuǎn)錄；（3）末端修復(fù)、3′端加A；（4）接頭鏈接、片段選擇；（5）PCR富集；（6）文庫(kù)質(zhì)控；（7）上機(jī)測(cè)序。使用FPKM來(lái)表達(dá)各基因的表達(dá)水平。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 基于癌基因圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)直腸癌的TCGA-COAD數(shù)據(jù)集，使用GEPIA在線工具對(duì)Rab25與結(jié)直腸癌的生存期和耐藥標(biāo)志性蛋白進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，具體步驟如下：TCGA下載結(jié)直腸癌TCGA-COAD數(shù)據(jù)集，提取Rab25的表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床預(yù)后信息，將COAD患者分為Rab25高表達(dá)和低表達(dá)兩組，使用Kalpan-Meier（KM）統(tǒng)計(jì)方法分析兩組間總生存期（OS）和無(wú)疾病生存期（DFS）。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和檢索NCBI Gene庫(kù)，確定結(jié)直腸癌耐藥相關(guān)性蛋白，使用GEPIA在線基因關(guān)聯(lián)性分析工具分析Rab25與結(jié)直腸癌耐藥相關(guān)性蛋白的相關(guān)性。

1.2.6 RT-PCR 引物設(shè)計(jì)合成后，先提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定濃度，合成cDNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每個(gè)樣轉(zhuǎn)錄體系為5×RT Buffer 2 μL，Enzyme 0.5 μL，Primer 0.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄完成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為SYBR 5 μL，F(xiàn)orward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Diluted cDNA 4.5 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋篐old（預(yù)變性）；95 ℃，30 s，40 Cycles；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，擴(kuò)增時(shí)間約為101 min。擴(kuò)增結(jié)束后，使用ΔΔCT法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組RNA表達(dá)差異倍數(shù)。

1.2.7 免疫蛋白印跡 用1%PMSF RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按上樣量制備上樣樣品，制備15%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加20 μg樣品進(jìn)行電泳，結(jié)束后再用恒流0.3 A于冰上2 h電轉(zhuǎn)，取出PVDF膜，TBST洗滌3次，5%封閉液室溫封閉2 h。Rab25蛋白抗體稀釋比例為1∶5 000，β-actin蛋白抗體稀釋比例為1∶10 000，一抗4℃，孵育14TBST洗滌3次；孵育二抗，二抗稀釋比例為1∶5 000，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次；放入ChemiDocTM XRS+成像系統(tǒng)成像，顯影觀察。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞加入藥物處理，藥物作用特定時(shí)間后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞。細(xì)胞固定，預(yù)冷的1×PBS洗滌收集的細(xì)胞3次，收集細(xì)胞沉淀，棄上清，加入適量體積預(yù)冷70%乙醇4℃過(guò)夜固定。細(xì)胞染色：預(yù)冷PBS溶液洗滌，加入適量體積400 μL CCAA溶液，避光孵育30 min。以標(biāo)準(zhǔn)程序使用Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞周期結(jié)果用Modfit LT.0進(jìn)行擬合，凋亡結(jié)果用FlowJo 10.7.2進(jìn)行分析。凋亡不需要酒精固定直接采用Annexin V-FITC/PI雙染色法染色后上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)涉及的所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，兩個(gè)樣本均數(shù)間的差異比較使用t檢驗(yàn)，三個(gè)樣本間的及以上均數(shù)間的比較使用多因素方差分析進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌細(xì)胞耐藥時(shí)形態(tài)發(fā)生變化 倒置相差光學(xué)顯微鏡下，見(jiàn)親本株與耐藥株均呈單層貼壁生長(zhǎng)，高倍鏡下見(jiàn)耐藥株細(xì)胞多呈不規(guī)則卵圓形或菱形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)顆粒較為疏散，而親本株HCT-8細(xì)胞多為呈長(zhǎng)條梭形，細(xì)胞核相對(duì)較小，細(xì)胞質(zhì)顆粒緊密，3種細(xì)胞核仁折光性相當(dāng)，見(jiàn)圖1。

圖1 耐藥株與HCT-8親本株形態(tài)學(xué)差異比較（倒置相差顯微鏡）Fig.1 Morphological comparison of the chemoresistance colorectal cancer cell line（inverted phase contrast microscope）

2.2 耐藥株細(xì)胞鑒定 用不同濃度梯度抗癌藥物處理親本株和耐藥株細(xì)胞，一定時(shí)間后計(jì)算各個(gè)濃度細(xì)胞存活率及耐藥指數(shù)，結(jié)果顯示，耐藥株對(duì)應(yīng)相同濃度的細(xì)胞存活比率比較均比親本株高（P＜0.05）。HCT-8/DDP的24 h和48 h耐藥指數(shù)分別為3.45和5.26，HCT-8/Fu的48 h和72 h耐藥指數(shù)分別為5.55和7.27，見(jiàn)圖2。

圖2 抗癌藥物處理結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞存活曲線Fig.2 Cell survival curves of chemoresistance cell strains treated with DDP or 5-Fu

2.3 GTP酶Rab家族在耐藥株細(xì)胞表達(dá)發(fā)生變化 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選結(jié)果顯示，在篩選的可能與耐藥相關(guān)的GTP酶Rab家族目的基因中，至少有5個(gè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其中，比起結(jié)直腸癌HCT-8親本株，HCT-8/DDP的Rab25、Rab32和Rab38基因表達(dá)水平均顯著降低，降低倍數(shù)分別為12.36、7.10和7.15倍，HCT-8/Fu降低倍數(shù)分別為10.29、7.40和5.88倍（P＜0.001）。由于Rab25在囊泡運(yùn)輸起關(guān)鍵作用以及其差異最為顯著，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選擇了Rab25作為研究重點(diǎn)，見(jiàn)表1。

表1 親本株與耐藥株GTP酶Rab家族相對(duì)表達(dá)Tab.1 GTPase Rab family expression of HCT8 strain and drμg-resistant cells

2.4 Rab25與結(jié)直腸癌患者預(yù)后及耐藥蛋白有關(guān) 為初步評(píng)估Rab25在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值，利用GEPIA基因表達(dá)譜交互分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的TCGA-COAD數(shù)據(jù)集及基因關(guān)聯(lián)性，共篩選104例COAD關(guān)于Rab25表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，Rab25與結(jié)直腸癌的總生存期存在相關(guān)性（圖3），高表達(dá)Rab25的結(jié)直腸癌患者總體生存期更長(zhǎng)（HR=0.4，P＜0.05），并且Rab25在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)與結(jié)直腸癌耐藥標(biāo)志蛋白abcb1、abcc1和abcg2均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。

圖3 Rab25表達(dá)與患者預(yù)后和多藥耐藥標(biāo)志物相關(guān)Fig.3 Rab25 expression is associated with patient prognosis and multidrμg resistance markers

2.5 耐藥細(xì)胞Rab25表達(dá)鑒定及調(diào)控 耐藥株Rab25的RNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量均低于親本株HCT-8（P＜0.001）。Rab25質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h之后，比起轉(zhuǎn)染空載的陰性對(duì)照組（NC），HCT-8/DDP和HCT-8/Fu的Rab25的RNA表達(dá)水平分別是其（31.79±3.19）和（23.58±2.58）倍（圖4），蛋白相對(duì)表達(dá)量較NC均明顯增高（P＜0.001）。

圖4 耐藥株轉(zhuǎn)染Rab25質(zhì)粒的表達(dá)水平Fig.4 The expression level of Rab25 in chemoresistance cell strains

2.6 上調(diào)Rab25增加結(jié)直腸癌耐藥株細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性 過(guò)表達(dá)Rab25之后，用梯度濃度抗癌藥物處理耐藥株一定時(shí)間，MTT結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Rab25顯著降低耐藥株的細(xì)胞存活率（P＜0.01），上調(diào)Rab25的HCT8/DDP相對(duì)于轉(zhuǎn)染空載的24 h和48 h耐藥指數(shù)分別為0.40和0.38，上調(diào)Rab25的HCT8/Fu相對(duì)于轉(zhuǎn)染空載的48 h和72 h耐藥指數(shù)分別為0.21和0.23（圖5）。

圖5 結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株上調(diào)Rab25的細(xì)胞存活曲線Fig.5 The cell survival curve of colorectal cancer chemoresistance cell lines treated with anticancer drμgs after Rab25 was up-regulated

2.7 上調(diào)Rab25增強(qiáng)藥物對(duì)細(xì)胞G0/G1期的阻滯轉(zhuǎn)染Rab25質(zhì)粒和空載48 h后，用0、10、50 μg/mL濃度DDP處理HCT-8/DDP細(xì)胞12 h，0、20、80 μg/mL濃度5-Fu處理HCT-8/Fu細(xì)胞48 h，流式結(jié)果顯示，比起轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Rab25的細(xì)胞表現(xiàn)出G0/G1期阻滯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2-3。

表2 DDP處理后的細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycle under treatment of DDP ±s

表2 DDP處理后的細(xì)胞周期Tab.2 Cell cycle under treatment of DDP ±s

注：與NC組比較，*P＜0.05

NC pCMV3-Rab25-Flag細(xì)胞周期SubG1（%）G0/G1（%）S（%）G2/M（%）0 μg/mL 2.34±0.18 23.59±1.79 47.01±2.74 27.18±0.99 10 μg/mL 3.11±0.57 33.00±1.23 34.59±2.71 29.17±1.47 50 μg/mL 3.07±0.12 34.92±2.19 27.48±2.01 35.65±3.35 0 μg/mL 1.97±0.27 25.24±2.14 44.55±2.85 28.21±1.41 10 μg/mL 5.11±0.29 46.67±3.02*28.11±1.84*20.87±0.65*50 μg/mL 4.21±0.15 48.81±3.37*21.99±2.29*26.08±2.43*

表3 5-Fu處理后的細(xì)胞周期Tab.3 Cell cycle under treatment of 5-Fu ±s

表3 5-Fu處理后的細(xì)胞周期Tab.3 Cell cycle under treatment of 5-Fu ±s

注：*P＜0.05 vs.NC

Phase NC pCMV3-Rab25-Flag SubG1（%）G0/G1（%）S（%）G2/M（%）0 μg/mL 1.12±0.16 23.18±1.86 44.25±4.23 31.57±2.14 20 μg/mL 2.98±0.54 24.34±1.51 40.57±3.08 33.09±2.11 80 μg/mL 4.47±0.39 31.56±1.78 36.77±2.48 28.31±1.09 0 μg/mL 1.83±0.16 24.77±1.87 42.89±3.01 30.53±1.08 20 μg/mL 10.09±0.17 39.18±2.53*29.162±2.03*22.57±1.73*80 μg/mL 9.13±1.70 42.46±2.90*28.18±2.18*19.40±1.67*

2.8 上調(diào)Rab25增強(qiáng)藥物的致細(xì)胞凋亡作用 轉(zhuǎn)染Rab25質(zhì)粒和空載48 h后，用0、10、50 μg/mL濃度DDP處理HCT-8/DDP細(xì)胞12 h，0、20、80 μg/mL濃度5-Fu處理HCT-8/Fu細(xì)胞48 h，流式結(jié)果顯示，比起轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Rab25的細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖6）。

圖6 上調(diào)Rab25對(duì)結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞耐藥時(shí)細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Rab25 affects the cell apoptosis of colorectal cancer chemoresistance cells during chemotherapy resistance.

3 討論

耐藥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其中包括微環(huán)境和細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變［9-10］。目前國(guó)內(nèi)外結(jié)直腸癌耐藥基因研究仍然有限，尋找新的克服結(jié)直腸癌耐藥基因靶點(diǎn)至關(guān)重要。已有研究證明了GTP酶家族如rho A、rho B、rho E等突變?cè)诮閷?dǎo)癌癥化療耐藥中的作用，它們可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥性［11］，但涉及結(jié)直腸癌癥耐藥的研究較少。

根據(jù)LONGDEN等［12］的研究，推測(cè)細(xì)胞形態(tài)改變有利于癌細(xì)胞減少與抗癌藥物的接觸并將藥物排出。細(xì)胞的增殖能力與耐藥指數(shù)也證明DDP和5-Fu耐藥株對(duì)抗癌藥物具備良好的耐受能力。

結(jié)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、ZHENG等［13］和GARDAMA等［14］的研究來(lái)看，GTP酶Rab家族在耐藥過(guò)程中變化顯著，值得一提的是，這種變化在不同的耐藥株里面的變化一致，這提示在結(jié)直腸癌多藥耐藥中，它們可能以同樣的機(jī)制介導(dǎo)不一樣的抗癌藥物耐藥。有研究［15］表明Rab25在多種癌癥中與囊泡運(yùn)輸有著密切的關(guān)系，充當(dāng)著將藥物運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵因子，后續(xù)利用TCGA-COAD數(shù)據(jù)集篩選其相關(guān)的結(jié)直腸癌臨床數(shù)據(jù)，生物信息分析初步顯示了Rab25表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后和多藥耐藥蛋白的關(guān)聯(lián)性。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，Rab25的mRNA和蛋白水平都在結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中顯著降低，通過(guò)調(diào)控Rab25表達(dá)，Rab25上調(diào)逆轉(zhuǎn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的耐藥性。

為進(jìn)一步探究Rab25影響結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥作用，檢測(cè)了上調(diào)Rab25對(duì)結(jié)直腸癌耐藥株細(xì)胞耐藥時(shí)的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，有研究顯示，miRNA可通過(guò)增加G0/G1期、降低S期和G2/M期細(xì)胞提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性［16］，但本研究發(fā)現(xiàn)，在加入DDP或者5-Fu作用一定時(shí)間后，S期細(xì)胞降低減少，這說(shuō)明藥物本身影響了耐藥細(xì)胞的DNA合成，這是由藥物的作用機(jī)制決定的，增多的G0/G1期細(xì)胞意味著停止分裂的細(xì)胞增多，這可能與細(xì)胞開始“疲于應(yīng)對(duì)”抗癌藥物的殺傷作用有關(guān)。

此外，抗癌藥物本身可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡殺傷細(xì)胞，但耐藥細(xì)胞能阻止此過(guò)程發(fā)生［17］，而上調(diào)Rab25表達(dá)使得抗癌藥物重新增強(qiáng)細(xì)胞的致凋亡作用，尤其表現(xiàn)在晚期凋亡，這種效應(yīng)在給予高濃度藥物處理時(shí)更加顯著，這與其影響直腸癌細(xì)胞耐藥過(guò)程中SubG1期的增高一致，因?yàn)镾ubG1期的細(xì)胞增多一般意味著凋亡細(xì)胞增多，不過(guò)，更深的分子機(jī)制需要進(jìn)一步探索。

綜上，本研究利用構(gòu)建的結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞，證實(shí)了Rab25是克服結(jié)直腸癌DDP和5-Fu耐藥的關(guān)鍵基因。這可為臨床解決結(jié)直腸癌耐藥問(wèn)題提供新的理論基礎(chǔ)，為開發(fā)針對(duì)Rab25或其他Rab家族靶點(diǎn)的治療策略提供新的思路。