吳 攀， 劉成敏， 葉知瑤， 吳成鳳， 徐理茂

(成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 成都 611730)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，在機(jī)體免疫應(yīng)答的過程往往會造成肝細(xì)胞損傷和破壞，進(jìn)而引起肝組織發(fā)炎，導(dǎo)致一系列癥狀和肝功能檢查異常，即發(fā)生乙型肝炎[1]。HBV感染后在多種因素作用下可能逐步演進(jìn)為慢性肝炎、肝硬化、肝癌。據(jù)調(diào)查，由于慢性炎癥的反復(fù)發(fā)作，20%～30%的患者會發(fā)展為肝硬化或肝癌[2]。乙型肝炎給患者及社會均帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，研究其發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來備受關(guān)注的一類分子，廣泛參與細(xì)胞生長、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生及病毒感染發(fā)病機(jī)制等多種生命過程[3]。其中，微小RNA-27a(miR-27a)、微小RNA-625(miR-625)分別在肝癌、肝硬化中差異表達(dá)，但在乙型肝炎的表達(dá)尚不明確[4,5]。本研究將通過檢測乙型肝炎患者血清miR-27a、miR-625表達(dá)水平，研究二者與肝硬化、肝癌的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年11月至2021年2月在成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的慢性乙型肝炎患者67例作為乙型肝炎組、乙型肝炎后肝硬化患者63例作為肝硬化組、乙型肝炎后肝癌患者65例作為肝癌組，選取同期健康體檢者65例作為對照組。四組受試者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①慢性乙型肝炎診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的相關(guān)內(nèi)容[6]，年齡>40歲；②乙型肝炎后肝硬化診斷符合《肝硬化診治指南》[7]中的相關(guān)內(nèi)容，年齡>40歲；③乙型肝炎后肝癌診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[8]中的相關(guān)內(nèi)容，且經(jīng)病理檢查確診；④臨床檢查資料完整者；⑤無精神疾患，可正常溝通。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤、其他肝炎病毒感染、其他肝病、嚴(yán)重全身性疾病者；②近6個(gè)月內(nèi)使用過干擾素、核苷酸類似物抗病毒治療者；③近6個(gè)月內(nèi)使用過激素等免疫調(diào)節(jié)劑者；④妊娠婦女。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器:逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AB-4366596)購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒(貨號：SK1321)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Mix)(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

表1 四組受試者一般資料比較

1.3qRT-PCR法檢測血清miR-27a、miR-625表達(dá)水平

1.3.1總RNA提取:四組受試者均于清晨取空腹外周靜脈血5mL，4℃ 3000r/min離心10min，分離血清。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加Trizol試劑，3000r/min離心10min，收集上清。用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度，以260、280nm波長處RNA樣本吸光度值比值處于1.8～2.0為合格。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.3.2cDNA合成:使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加1μL總RNA、1μL通用引物、9μL ddH2O于無菌Eppendof管中，置于65℃水中5min，冰上5min；依次加入5×buffer 4μL、RNA酶抑制劑1μL，10mmoL/L dNTP 2μL和逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，使用DEPC水補(bǔ)至20μL，充分混勻后在水浴鍋中42℃水浴60min，70℃水浴5min。使用qRT-PCR儀按45℃ 25min、95℃ 5min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。檢驗(yàn)合成cDNA的質(zhì)量，合格后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3qRT-PCR法檢測miR-27a、miR-625水平:以U6為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR儀對miR-27a、miR-625進(jìn)行擴(kuò)增。miR-27a、miR-625、U6上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，10μL反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 5μL、50 ng/μL cDNA 1 μL、10 μM上下游引物各0.5μL、ddH2O 3μL。反應(yīng)條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)終止。miR-27a上游引物：5′-GCGCTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-625上游引物：5′-AGGGGGAAAGTTCTATAGTCC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-27a、miR-625相對表達(dá)量以2-ΔΔCt法表示，Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1四組血清miR-27a、miR-625水平:與對照組比較，乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)；與乙型肝炎組比較，肝硬化組、肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)；與肝硬化組比較，肝癌組血清miR-27a水平顯著升高，miR-625水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 四組血清miR-27a miR-625水平比較

2.2影響乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的多因素分析:將乙型肝炎后肝硬化是否發(fā)生作為因變量，以血清miR-27a、miR-625水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-27a水平為影響乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，血清miR-625水平為影響乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的多因素分析

2.3ROC曲線分析血清miR-27a、miR-625水平對乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的預(yù)測價(jià)值:血清miR-27a水平預(yù)測乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的曲線下面積(AUC)為0.708(95%CI：0.620～0.797)，截?cái)嘀禐?.24，敏感度為73.02%，特異度為61.19%，約登指數(shù)為0.342；血清miR-625水平預(yù)測乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的AUC為0.761(95%CI：0.680～0.843)，截?cái)嘀禐?.80，敏感度為68.25%，特異度為73.13%，約登指數(shù)為0.414。血清miR-27a、miR-625二者聯(lián)合預(yù)測乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的AUC為0.815(95%CI：0.743～0.888)，敏感度為65.08%，特異度為85.07%，約登指數(shù)為0.502。見圖1。

2.4影響乙型肝炎后肝癌發(fā)生的多因素分析:將乙型肝炎后肝癌是否發(fā)生作為因變量，以血清miR-27a、miR-625水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-27a水平為影響乙型肝炎后肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，血清miR-625水平為影響乙型肝炎后肝癌發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響乙型肝炎后肝癌發(fā)生的多因素分析

圖1 血清miR-27a、miR-625水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測乙型肝炎后肝硬化發(fā)生的ROC曲線

2.5ROC曲線分析血清miR-27a、miR-625水平對乙型肝炎后肝癌發(fā)生的預(yù)測價(jià)值:血清miR-27a水平預(yù)測乙型肝炎后肝癌發(fā)生的AUC為0.870(95%CI：0.812～0.929)，截?cái)嘀禐?.42，敏感度為79.23%，特異度為66.57%，約登指數(shù)為0.458；血清miR-625水平預(yù)測乙型肝炎后肝癌發(fā)生的AUC為0.913(95%CI：0.864～0.963)，截?cái)嘀禐?.71，敏感度為76.92%，特異度為72.54%，約登指數(shù)為0.495；血清miR-27a、miR-625二者聯(lián)合預(yù)測乙型肝炎后肝癌發(fā)生的AUC為0.966(95%CI：0.938～0.993)，敏感度為73.64%，特異度為89.55%，約登指數(shù)為0.632。見圖2。

圖2 血清miR-27a、miR-625水平單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測乙型肝炎后肝癌發(fā)生的ROC曲線

3 討 論

HBV是一種親肝且具有泛嗜性的DNA病毒，中國HBV表面抗原攜帶者占全國人口的7.18%[9]。感染HBV后，患者的肝臟經(jīng)歷反復(fù)損傷和修復(fù)過程，引發(fā)慢性乙型肝炎，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化及肝癌，嚴(yán)重影響患者的生命健康。而在HBV感染后的發(fā)展過程中，患者臨床表現(xiàn)不明顯，不易作出準(zhǔn)確診斷。因此，尋找與HBV感染后發(fā)展過程有關(guān)的生物標(biāo)志物，對防治乙型肝炎進(jìn)一步發(fā)展惡化具有重要意義。

miRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，可在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生及病毒感染發(fā)病機(jī)制等過程。據(jù)報(bào)道，miRNA在HBV引起的肝臟慢性損傷過程中存在差異性表達(dá)，參與該進(jìn)程的發(fā)生、發(fā)展，且具有更高的組織特異性和可靠性[10]。徐蘭鋒等[11]研究表明，血清miR-122、miR-130a水平對隱匿性乙型肝炎有重要診斷價(jià)值。miR-27a、miR-625是癌癥中發(fā)揮重要作用的miRNA，在大多數(shù)癌癥中差異表達(dá)，分別發(fā)揮促癌及抑癌作用。有研究表明，miR-27a在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，而miR-625可抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[12]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a、miR-625在HBV感染發(fā)展中差異表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，從對照組、乙型肝炎組、肝硬化組到肝癌組，受試者血清miR-27a水平依次升高，miR-625水平依次降低，提示在乙型肝炎發(fā)生及向肝硬化、肝癌進(jìn)展過程中，miR-27a、miR-625的表達(dá)受到嚴(yán)重影響，二者很可能參與HBV感染后乙型肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。有研究亦表明，miR-27a可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[13]。而肝硬化患者miR-625表達(dá)下調(diào)，可作為肝硬化的生物標(biāo)志物[5]。回歸分析顯示，血清miR-27a、miR-625水平分別為影響乙型肝炎后肝硬化、肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和保護(hù)因素，提示血清miR-27a、miR-625水平的變化可能改變乙型肝炎發(fā)生肝硬化、肝癌的可能性，推測通過降低血清miR-27a水平、升高miR-625水平可能有助于預(yù)防乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化、肝癌。ROC曲線分析結(jié)果顯示，表明血清miR-27a、miR-625對乙型肝炎后肝硬化、肝癌的發(fā)生均有一定的預(yù)測價(jià)值，二者聯(lián)合預(yù)測乙型肝炎后肝硬化、肝癌發(fā)生的效果更好。

綜上所述，隨著乙型肝炎的發(fā)生及向肝硬化、肝癌進(jìn)展，血清miR-27a、miR-625水平分別升高和降低，且兩者分別為影響乙型肝炎后肝硬化、肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和保護(hù)因素，對乙型肝炎后肝硬化、肝癌的發(fā)生均有一定的預(yù)測價(jià)值。本研究雖初步明確了miR-27a、miR-625與乙型肝炎進(jìn)展的關(guān)系，但納入樣本量相對較少，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本探討兩者在乙型肝炎預(yù)后中的作用。