周安付， 譚 琰， 張惠晶

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 海南 ?？?570102 2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡科， 遼寧 沈陽 110001)

胃癌是常見的且致死率高的消化道惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的第三大病因，腫瘤轉(zhuǎn)移威脅著胃癌患者的治療效果，尋求新的胃癌診斷和治療靶點仍然是研究的重點[1,2]。腫瘤免疫學(xué)研究不斷發(fā)現(xiàn)，多種免疫細胞和免疫檢查點均可用于惡性腫瘤的治療，其中，巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細胞，可分為M1和M2兩種表型，M1型巨噬細胞具有促炎作用，但研究表明，M2型巨噬細胞與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等密切相關(guān)，亦與患者的預(yù)后密切相關(guān)[3]。腫瘤外泌體是一類由腫瘤細胞分泌的納米級囊泡，研究表明，腫瘤外泌體可調(diào)控腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸等病理進程，或可用于腫瘤的治療和診斷[4]。外泌體內(nèi)含lncRNA、miRNA、circRNA等遺傳物質(zhì)而調(diào)控靶組織和靶器官的功能，外泌體lncRNA可通過多種途徑調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展，例如，外泌體lncRNA HOTTIP可調(diào)控胃癌的順鉑耐藥[5]。在巨噬細胞調(diào)控方面，結(jié)直腸癌外泌體lncRNA RPPH1可促進M2型巨噬細胞極化[6]，而胃癌外泌體lncRNA對巨噬細胞的調(diào)控尚無探究，lncRNA CASC11被研究在胃癌中高表達并且可調(diào)控胃癌的增殖、遷移以及侵襲[7]，本文探究了胃癌外泌體中l(wèi)ncRNA CASC11對巨噬細胞極化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料:人胃粘膜細胞GES-1，人胃癌細胞株MGC-803、SGC7901、MKN45，人單核細胞系THP1(購自中科院上海細胞庫)，脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑盒(購自美國Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒(購自TaKaRa公司)，TSG101、CD9、CD63、TLR4、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH抗體，山羊抗兔IgG二抗(購自美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2細胞培養(yǎng):GES-1細胞和MGC-803、MKN45、SGC7901細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，THP1細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和50μmoL/L β巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基中，THP1細胞中加入100 ng/mL PMA培養(yǎng)48h后，使THP1分化為人單核巨噬細胞(M0型巨噬細胞)。共孵育：將THP1細胞在6孔板中誘導(dǎo)分化為M0型巨噬細胞，然后將6孔板中的培養(yǎng)基更換為含10μg/mL的外泌體，共孵育48h進行后續(xù)研究。

1.3細胞分組與轉(zhuǎn)染:THP-1細胞分為Vector組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)和lncRNA CASC11組(轉(zhuǎn)染lncRNA CASC11過表達質(zhì)粒)，MGC-803細胞分為Vector組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒)和lncRNA CASC11組(轉(zhuǎn)染lncRNA CASC11過表達質(zhì)粒)，按照上述分組，使用LipofectamineTM 2000試劑盒進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)研究。

1.4外泌體的提取和鑒定:將各組細胞的培養(yǎng)基更換為含無外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后收集細胞培養(yǎng)液，3000×g，離心15min，收集上清，100 000×g，離心70min，收集沉淀，加入10mL的PBS溶液重懸，100 000×g，離心70min，所得沉淀即為外泌體，用400μL PBS重懸后，-80℃保存。于透射電鏡下觀察外泌體的結(jié)構(gòu)，Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白TSG101、CD9、CD63。

1.5qRT-PCR:使用Trizol試劑盒提取GES-1細胞、各組胃癌細胞以及各組外泌體中的RNA，定量后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒合成cDNA，SYBR Green qPCR試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)，使用2-ΔΔCT法檢測lncRNA CASC11及相關(guān)基因mRNA的表達。見表1。

1.6流式細胞術(shù):取各組待檢測的巨噬細胞5×105個重懸于200μL PBS溶液，每組細胞中加入2μg FITC-CD206抗體 和PE-CD14 抗體，避光條件下室溫孵育30min，設(shè)置單獨加入FITC-CD206抗體和單獨加入PE-CD14 抗體的組別用于調(diào)補償，孵育后用PBS清洗1次，流式細胞儀上機檢測CD206+CD14+細胞比例。

表1 基因引物序列

1.7Western blot:使用RIPA蛋白裂解液試劑盒提取各組細胞及外泌體中的總蛋白，BCA試劑盒蛋白定量后，取每組蛋白10μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后進行PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉后將PVDF膜與TSG101、CD9、CD63、TLR4、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH一抗共孵育過夜，洗膜后與二抗孵育1.5h，TBST清洗后，使用ECL試劑盒曝光，拍照，進行蛋白定量。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析:使用GraphPad prism軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間計量資料的比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1外泌體鑒定結(jié)果:透射電鏡檢測結(jié)果(圖1A)顯示，GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo、SGC7901 exo粒徑在30～100nm之間，具有雙層膜結(jié)構(gòu)。Western blot檢測(圖1B)顯示，GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo、SGC7901 exo均表達TSG101、CD9、CD63，符合外泌體的特征。

圖1 外泌體鑒定結(jié)果

2.2lncRNA CASC11高表達于胃癌細胞及其外泌體:qRT-PCR檢測結(jié)果(表2)顯示，相比于GES-1細胞，MGC-803、MKN45、SGC7901細胞中l(wèi)ncRNA CASC11表達顯著增加(P<0.05)，相比于GES-1 exo，MGC-803 exo、MKN45 exo、SGC7901 exo中l(wèi)ncRNA CASC11表達亦顯著增加(P<0.05)，說明lncRNA CASC11高表達于胃癌細胞及其外泌體。

表2 各組細胞及外泌體lncRNA CASC11表達量比較

2.3lncRNA CASC11誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化:qRT-PCR和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(表3，表4，表5)顯示，相比于Vector組，lncRNA CASC11組巨噬細胞中M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS、CD16表達顯著下調(diào)(P<0.05)，M2型巨噬細胞標(biāo)志物CD206、Arg-1和Ym1表達顯著上調(diào)(P<0.05)，M1型巨噬細胞特異型細胞因子TNF-α和IL-1β表達顯著減少(P<0.05)，M2型巨噬細胞特異型細胞因子TGF-β和IL-10表達顯著增加(P<0.05)，CD206+CD14+細胞比例顯著增加(P<0.05)，說明lncRNA CASC11可顯著誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化。

表3 各組細胞iNOS CD16 CD206 Arg-1和Ym1表達比較

表4 各組細胞TNF-α IL-1β TGF-β IL-10表達比較

2.4胃癌外泌體誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化:將外泌體與單核巨噬細胞孵育后，檢測結(jié)果(表6，表7，表8)顯示，相比于PBS組，MGC-803 exo、MKN45 exo和SGC7901 exo組巨噬細胞中M2型巨噬細胞標(biāo)志物CD206、Arg-1和Ym1表達顯著上調(diào)(P<0.05)，M2型巨噬細胞特異型細胞因子TGF-β和IL-10表達顯著增加(P<0.05)，CD206+CD14+細胞比例顯著增加(P<0.05)，M1型巨噬細胞標(biāo)志物iNOS、CD16表達顯著下調(diào)(P<0.05)，M1型巨噬細胞特異型細胞因子TNF-α和IL-1β表達顯著減少(P<0.05)，而GES-1 exo組細胞上述指標(biāo)無顯著變化(P>0.05)，說明胃癌細胞外泌體可顯著誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化。

表5 各組細胞CD206+ CD14+細胞比例

表6 各組細胞iNOS CD16 CD206 Arg-1和Ym1表達比較

表7 各組細胞TNF-α IL-1β TGF-β IL-10表達比較

圖2 流式細胞術(shù)檢測lncRNA CASC11對巨噬細胞極化的影響

圖3 流式細胞術(shù)檢測外泌體對巨噬細胞極化的影響

表8 各組細胞CD206+ CD14+細胞比例比較

2.5胃癌細胞外泌體運輸lncRNA CASC11至巨噬細胞:相比于PBS組，MGC-803 exo、MKN45 exo和SGC7901 exo組巨噬細胞中l(wèi)ncRNA CASC11表達顯著增加(P<0.05)，而GES-1 exo組巨噬細胞中l(wèi)ncRNA CASC11表達無顯著變化(P>0.05)。在MGC-803細胞中轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒(Vector)和轉(zhuǎn)染lncRNA CASC11過表達質(zhì)粒(lncRNA CASC11)后提取MGC-803細胞所分泌的外泌體(Vector exo和CASC11 exo)，將Vector exo和CASC11 exo與單核巨噬細胞共孵育后，相比于Vector exo組細胞，CASC11 exo巨噬細胞中l(wèi)ncRNA CASC11表達顯著增加(P<0.05)，說明胃癌細胞外泌體可轉(zhuǎn)移lncRNA CASC11至巨噬細胞(表9)。

表9 各組細胞lncRNA CASC11表達量比較

2.6外泌體lncRNA CASC11誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化:將Vector exo和CASC11 exo與單核巨噬細胞共孵育后，qRT-PCR和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖4，表10、表11、表12)顯示，相比于Vector exo組，CASC11 exo組巨噬細胞中M2型巨噬細胞標(biāo)志物CD206、Arg-1和Ym1表達顯著上調(diào)(P<0.05)，M2型巨噬細胞特異型細胞因子TGF-β和IL-10表達顯著增加(P<0.05)，CD206+CD14+細胞比例顯著增加(P<0.05)，說明外泌體lncRNA CASC11可顯著誘導(dǎo)M2型巨噬細胞極化。

表10 各組細胞iNOS CD16 CD206 Arg-1和Ym1表達比較

表11 各組細胞TNF-α IL-1β TGF-β IL-10表達比較

表12 各組細胞CD206+ CD14+細胞比例比較

2.7外泌體lncRNA CASC11影響TLR4/NF-κB信號通路:Western blot檢測結(jié)果(圖5，表13)顯示，相比于PBS組，MGC-803 exo、MKN45 exo和SGC7901 exo組巨噬細胞中TLR4顯著下調(diào)(P<0.01)，NF-κB磷酸化水平亦顯著降低(P<0.001)，而GES-1 exo組巨噬細胞中TLR4表達和NF-κB磷酸化水平均無顯著變化。相比于Vector exo組，CASC11 exo組巨噬細胞中TLR4顯著下調(diào)(P<0.001)，NF-κB磷酸化水平亦顯著降低(P<0.001)，說明外泌體lncRNA CASC11可顯著抑制TLR4/NF-κB信號通路。

表13 各組細胞TLR4表達和NF-κB磷酸化比較

圖4 流式細胞術(shù)檢測CASC11 exo對巨噬細胞極化的影響

圖5 Western blot檢測胃癌外泌體(A)以及外泌體lncRNA CASC11(B)對TLR4表達和NF-κB磷酸化的影響

3 討 論

腫瘤外泌體是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，腫瘤母細胞將攜帶各種遺傳物質(zhì)的外泌體分泌至腫瘤微環(huán)境中而調(diào)控腫瘤相關(guān)成纖維細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞或者中性粒細胞的形成而影響腫瘤的免疫逃逸，進而調(diào)控腫瘤進程[8]。胃癌細胞外泌體也可在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，據(jù)報道胃癌外泌體可調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進胃癌進程，外泌體也可調(diào)控中性粒細胞向N2型極化而促進胃癌的發(fā)展[9]。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫細胞，可分為M1和M2兩種表型，其中M2型巨噬細胞與腫瘤相關(guān)成纖維細胞相似，具有促進腫瘤發(fā)展的作用，研究表明，多種腫瘤細胞外泌體可調(diào)控M2型巨噬細胞的極化，胰腺癌外泌體可調(diào)控PTEN/PI3Kγ通路而促進M2型巨噬細胞的極化，結(jié)腸癌外泌體可誘導(dǎo)M2型巨噬細胞的極化而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。本研究將人胃粘膜細胞GES-1和人胃癌細胞株MGC-803、SGC7901、MKN45所分泌的外泌體分別與人單核巨噬細胞共孵育，發(fā)現(xiàn)MGC-803、SGC7901、MKN45所分泌的外泌體可顯著促進單核巨噬細胞向M2型極化，說明胃癌外泌體也具有促進巨噬細胞M2型極化的功能。

腫瘤外泌體內(nèi)含多種遺傳物質(zhì)，包括lncRNA、miRNA、circRNA等，腫瘤細胞將這些遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運至靶器官和靶細胞而發(fā)揮調(diào)控作用，其中，外泌體lncRNA被報道具有廣泛的調(diào)控作用，有望成為腫瘤治療的新靶點[11]，胃癌外泌體lncRNA亦可通過多種途徑調(diào)控腫瘤進程，如外泌體轉(zhuǎn)移lncRNA ZFAS1而促進胃癌的進程，血清外泌體lncRNA SLC2A12-10:1有望成為胃癌診斷的新靶點[12]。lncRNA CASC11已經(jīng)被報道可在膀胱癌、宮頸癌、食管癌中高表達而調(diào)控腫瘤的發(fā)展[13]，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC11在胃癌細胞及其外泌體中均高表達，并且lncRNA CASC11及胃癌外泌體中的lncRNA CASC11均可促進人單核巨噬細胞向M2表型分化。說明胃癌外泌體可通過轉(zhuǎn)移lncRNA CASC11而促進M2型巨噬細胞的形成。

研究表明巨噬細胞極化與TLR4/NF-κB信號通路密切相關(guān)，TLRs與配體結(jié)合后，作用于MyD88，MyD88促進下游IL-1R 相關(guān)激酶的磷酸化，進而將TRAF6募集至細胞膜，TRAF6富集TAK 復(fù)合體，進而調(diào)控IκB亞基的活性，而影響非活性巨噬細胞的 NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的活化。研究表明[14]，膠質(zhì)瘤外泌體可影響NF-κB通路而促進M2型巨噬細胞極化。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌外泌體以及外泌體中的lncRNA CASC11均可抑制TLR4的表達和NF-κB的磷酸化，即抑制TLR4/NF-κB信號通路。

綜上所述，胃癌外泌體中l(wèi)ncRNA CASC11可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路而促進M2型巨噬細胞的極化，但具體的調(diào)控機制還需進一步研究。