周 濤， 錢 永， 劉韋淞， 鄧 達， 趙方騰， 姜垂廣

(海南省腫瘤醫(yī)院頭頸外科， 海南 ?？?570312)

口腔上皮癌是世界上第六大最常見的癌癥，其預后很差，每年有超過50%的病例被診斷為口腔上皮癌[1]。研究發(fā)現口腔上皮癌的侵襲潛能與預后不良密切相關[2]。一些研究者已經證實深部浸潤前的高惡性分級對口腔上皮癌的頸部區(qū)域淋巴結轉移和預后具有預測價值。因此，為了改善口腔上皮癌患者的預后，必須闡明其潛在的侵襲機制和新的治療策略。近些年越來越多的研究發(fā)現COX-2在喉部鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、卵巢癌、肝癌等多種癌癥中均有過表達，且生存率低、預后差[3]。此外，研究發(fā)現COX-2可促進細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉移[4]。據報道COX-2可抑制細胞凋亡和免疫反應。吲哚美辛通過下調COX-2抑制人胰腺星狀細胞的增殖和活化[5]。另外，在胃癌和乳腺癌中，COX-2的表達與VEGF-C和淋巴管密切相關，提示COX-2與腫瘤轉移有關[6]。COX-2介導腫瘤間質催乳素信號以啟動腫瘤發(fā)生。但是有關COX-2具體調控口腔上皮癌發(fā)展的機制尚不明了。本研究主要通過分析COX-2調控口腔上皮癌KB細胞增殖、侵襲和EMT的作用機制，進一步闡明COX-2在口腔上皮癌發(fā)展過程中發(fā)揮的關鍵作用。

1 材料與方法

1.1主要材料:人口腔上皮癌組織和癌旁正常組織均來自本醫(yī)院，樣本的采取經過了患者和家屬的同意，并保存在-20℃?zhèn)溆谩Ｈ丝谇簧掀ぐ┘毎?KB細胞)及其人永生化口腔上皮細胞(HIOEC細胞)來自中國科學院上海細胞庫；DMEM(Dulbecco's-modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶來自購自Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒和SDA-PAGE試劑盒來自上海碧云天生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara；Trizol來自美國Invitrogen公司;塞來昔布(celecoxib)和AH6809來自美國APExBIO公司；E-cadherin、N-cadherin、p-JAK、p-STAT3抗體購自Abcam；DAB顯色試劑盒來自北京中杉金橋生物科技有限公司；COX-2抗體來自Cell Signaling Technology公司。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)和細胞轉染:取KB細胞和HIOEC細胞，用加入10% FBS、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞放在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中生長，待細胞融合度達90%左右時，用0.25%胰酶進行消化和傳代培養(yǎng)。傳代的細胞鋪于細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合達75%時，用Turbofect試劑按照說明書轉染質粒。

1.2.2慢病毒轉染:取長滿后的KB細胞，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的細胞接種于24孔板中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，待細胞匯合至75%時。用輔助質粒(GAG、REV、VSV-G)和目的基因轉染細胞，培養(yǎng)24 h，去上清，將2 mL Advanced DMEM，40μL血清，40μL L-Glu，20μL 1×chemically defined lipid concentrate，2μL 0.01 mmoL/L膽固醇和2μL 0.01 mmoL/L蛋黃卵磷脂混勻后加入細胞，48 h后收集上清液。將收集的慢病毒和500μL含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基混合，添加到KB細胞中，加入濃度為6μg/mL的聚凝胺，顯微鏡觀察細胞出現綠色熒光，添加終濃度為5μg/mL的嘌呤，觀察細胞發(fā)光數量達到90%以上，收取細胞系進行檢測。

1.2.3細胞增殖測定:取長滿后的KB穩(wěn)轉細胞系，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的KB細胞鋪于96孔板，每孔100μL，96孔板細胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞分為處理組和未處理組，皿底細胞觀察為70%～80%時，分別用celecoxib、AH6809或AG490處理細胞，于37℃、飽和濕度和5% CO2培養(yǎng)箱靜置48h，將10μL CCK-8工作液加入細胞中，慢慢晃勻后置于細胞培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)2 h，取出細胞培養(yǎng)板，在酶標儀上讀取各孔細胞在450 nm處的吸光值。

1.2.4細胞侵襲實驗:取長滿后的KB穩(wěn)轉細胞系，用0.25%胰酶進行消化，將稀釋后的KB細胞鋪于12孔板，觀察密度為70%～80%時，分別用celecoxib、AH6809或AG490處理細胞，長滿后進行消化制成細胞懸液，將100μL融化的Matrigel基質加入Transwell上室，上室中加入1×105個的細胞懸液，下室中加入600μL完全DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取出小室，加入4%多聚甲醛進行固定，取PBS加入其中進行洗滌，再加入0.1%結晶紫染色，20min后隨機選取5個視野中的細胞進行觀察和計數。

1.2.5ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中PGE2表達:將長滿后的KB穩(wěn)轉細胞系用0.25%胰酶消化，鋪于96孔板，在常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，皿底細胞觀察為70%～80%時，用celecoxib處理細胞，同時設置未處理組作為對照，于37℃、飽和濕度和5% CO2培養(yǎng)箱靜置48h，用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中PGE2表達。

1.2.6qRT-PCR:收取分別用celecoxib、AH6809或AG490處理后處于對數期的KB穩(wěn)轉細胞系，加入Trizol提取細胞總RNA，在紫外風光光度計下讀取RNA濃度和純度，取A260/280值在1.8～2.0范圍內的RNA樣品，根據反轉錄二步法將RNA反轉為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Real-Time試劑盒進行qRT-PCR，重復3個復孔，以GAPDH為內參，使用2-△△Ct法分析結果。引物見表1。

1.2.7Western blot:收取分別用celecoxib、AH6809或AG490處理后處于對數期的KB穩(wěn)轉細胞系，加入裂解液在冰上充分裂解，用BCA試劑盒定量上清蛋白的濃度，每孔取50μg蛋白進行點SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后通過濕轉儀器將蛋白轉移到PVDF膜上。加入5%的脫脂奶粉進行過夜封閉，封閉完成后PVDF膜在相應的的一抗中過夜孵育，加入TBST清洗5次，再和二抗在室溫條件下孵育2h，加入TBST清洗，清洗干凈后用ECL試劑盒進行蛋白曝光。

表1 引物序列

1.3統計學分析:用SPSS 16.0軟件進行統計分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05時，表示差異顯著或極顯著。

2 結 果

2.1COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調:由圖1A和1B結果可知，和癌旁正常組織相比，口腔上皮癌組織中COX-2的基因和蛋白表達量明顯上升(P<0.05)。由圖1C和1D結果可知，和HIOEC細胞相比，KB細胞中COX-2基因和蛋白表達量明顯升高(P<0.01)。以上結果表明COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調。

圖1 COX-2在口腔上皮癌組織和口腔上皮癌KB細胞中表達上調

2.2過表達COX-2促進KB細胞增殖、侵襲和EMT:由圖2A 可知，Lenti-COX-2細胞中COX-2的基因表達量明顯高于Lenti-GFP細胞(P<0.01)。由圖2B-2C可知，Lenti-COX-2細胞中COX-2的蛋白表達量明顯高于Lenti-GFP細胞(P<0.01)，說明過表達COX-2的KB穩(wěn)轉細胞系構建成功。由圖2D -2H結果可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞增殖能力明顯提高(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+celecoxib細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。表明COX-2能夠增強KB細胞的增殖、侵襲和EMT。

圖2 過表達COX-2促進KB細胞增殖、侵襲和EMT

2.3COX-2上調KB細胞內PGE2表達和激活JAK/STAT3通路:由圖3A-3C 可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞內PGE2表達明顯提高(P<0.001)，p-JAK/JAK比值明顯增加(P<0.01)，p-STAT3/STAT3比值明顯上升(P<0.01)，和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+celecoxib細胞內PGE2表達明顯降低(P<0.001)，p-JAK/JAK比值明顯降低(P<0.01)，p-STAT3/STAT3比值明顯降低(P<0.01)。表明COX-2能夠上調KB細胞內PGE2表達和激活JAK/STAT3通路。

圖3 COX-2上調KB細胞內PGE2表達和激活JAK/STAT3通路

2.4AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT:由圖4A-4E結果可知，和Lenti-GFP細胞相比，Lenti-COX-2細胞增殖能力明顯提高(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯增加(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。和Lenti-COX-2細胞相比，Lenti-COX-2+AH6809細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)，Lenti-COX-2+AG490細胞增殖能力明顯降低(P<0.05)，細胞侵襲數目明顯減少(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達量明顯上升(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。表明AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT。

圖4 AH6809或AG490作用細胞明顯抑制了KB細胞增殖、侵襲和EMT

3 討 論

口腔上皮癌是世界上最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率都在迅速上升，但其預后仍不理想。然而，口腔癌相關蛋白和基因的調控網絡尚不清楚，限制了臨床治療的改進，充分地了解參與惡性行為的蛋白可能有助于改善口腔癌的治療。近些年的研究表明COX-2能夠作為人類疾病的關鍵調節(jié)因子。如通過抑制COX-2過表達的癌細胞中的delta-5去飽和酶來抑制癌細胞的遷移和侵襲。本研究首先發(fā)現COX-2在口腔癌組織和KB細胞中表達上調，與上述研究結果一致，COX-2在口腔癌KB細胞中作為癌基因發(fā)揮作用。我們建立了COX-2的穩(wěn)轉細胞系，進一步研究表明過表達COX-2促進了KB細胞的增殖、侵襲和EMT，而用塞來西布抑制COX-2后，明顯下調了COX-2對KB細胞增殖、侵襲和EMT的促進作用。研究結果提示COX-2在口腔癌發(fā)展中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的新靶點。

后續(xù)研究發(fā)現COX-2上調KB細胞內PGE2表達和激活JAK/STAT3通路。PGE2作為花生四烯酸COX-2的主要催化產物，是COX-2的下游產物，且COX-2/PGE2通路在腫瘤發(fā)生中起關鍵作用。有文獻報道乙型肝炎病毒X蛋白可通過COX-2/PGE2信號通路促進了乙肝相關性肝細胞癌發(fā)展和轉移。研究發(fā)現PGE2具有4中受體，而其中PTGER2在PGE2參與的腫瘤發(fā)展中具有關鍵作用，抑制劑作用PTGER2能夠下調PGE2對腫瘤發(fā)展的調控作用。我們研究發(fā)現COX-2能夠上調KB細胞內PGE2表達，塞來西布抑制COX-2表達后，發(fā)現細胞培養(yǎng)液中PGE2表達量明顯降低。

考慮到COX-2/PGE2軸在腫瘤發(fā)展中的關鍵作用，我們用AH6809抑制了PGE2受體PTGER2的表達，進一步探討了KB細胞系的生物學功能，結果發(fā)現COX-2對KB細胞增殖、侵襲和EMT的促進作用明顯受到抑制。這些年的研究發(fā)現JAK/STAT3通路在癌癥增殖、侵襲和轉移過程中發(fā)揮了關鍵作用，如丹參酮I通過抑制JAK/STAT3信號通路抑制骨肉瘤的生長和轉移[7]。癌相關成纖維細胞通過分泌IL-11靶向JAK/STAT3/Bcl2途徑促進胃癌化療耐藥[8]。而且研究表明在肝癌細胞中，COX-2和JAK/STAT通路密切聯系，抑制COX-2的過度表達可能影響JAK/STAT細胞信號轉導通路的活性[9]。此外還發(fā)現小檗堿通過COX-2/PGE2介導的JAK2/STAT3信號通路抑制結直腸癌細胞的侵襲和轉移[10]。此外文獻報道在肝細胞癌(HCC)中，TLR4信號促進COX-2/PGE2/STAT3正反饋環(huán)路，參與HCC進展[11]。ATPγS通過/JAK2/STAT3/cpl(2)信號通路誘導A549細胞中COX-2的表達和PGE(2)的產生?？紤]到COX-2/PGE2與JAK2/STAT3信號通路在肺癌、直腸癌等癌癥中發(fā)揮的關鍵作用，我們猜想在口腔癌KB細胞中，COX-2/PGE2也可能通過JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮作用。因此我們用AG490抑制了KB細胞內JAK/STAT3通路，發(fā)現能夠過表達COX-2后，KB細胞的增殖、侵襲和EMT能力明顯下調。研究結果表明COX-2/PEGE/JAK-STAT3軸在口腔癌KB細胞發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用，值得進一步深入的研究。

綜上所述，該研究表明COX-2在口腔癌KB細胞中高表達，COX-2/PGE2激活JAK/STAT3信號通路促進人口腔癌KB細胞增殖、侵襲和EMT。本研究結果為口腔癌患者的靶向治療提供了新的研究方向。