童正飛 葛玲瑞, 胡亞洲,3 楊 濤 涂開(kāi)發(fā) 王 佩 周先文 王曉清,3 熊 鋼

中華鱉基因cDNA的克隆及組織表達(dá)分析*

童正飛1葛玲瑞1,2,3①胡亞洲1,3楊 濤1涂開(kāi)發(fā)1王 佩1周先文1王曉清1,3①熊 鋼2,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410127； 3. 湖南省水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為了探究中華鱉()的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)的結(jié)構(gòu)和功能，本研究利用RACE技術(shù)成功克隆獲得中華鱉基因的cDNA全長(zhǎng)序列，其長(zhǎng)度為1296 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)為807 bp，共編碼268個(gè)氨基酸，分為信號(hào)肽序列、Ⅱ類(lèi)組織相容性抗原結(jié)構(gòu)域、IGc1結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。通過(guò)NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，中華鱉與西部錦龜()親緣較近，而與哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及魚(yú)類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，mRNA在中華鱉8個(gè)組織中均有表達(dá)，在脾、心、肝及腸組織中表達(dá)水平較高，在肌肉組織中表達(dá)量最低。感染嗜水氣單胞菌() 12 h后，中華鱉mRNA在肝和腸組織中的表達(dá)顯著上調(diào)；感染1 d時(shí)，在脾組織中的表達(dá)顯著上調(diào)；感染1 d及5 d時(shí)，在腎組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，中華鱉基因參與了中華鱉免疫反應(yīng)。

中華鱉；；序列分析；基因表達(dá)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)是編碼主要組織相容性抗原的基因群的統(tǒng)稱(chēng)，在脊椎動(dòng)物抵抗疾病和免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用(馮美惠等, 2017)。MHC類(lèi)分子主要分為MHCⅠ和MHCⅡ，是由MHC基因編碼的一類(lèi)細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白，主要參與抗原呈遞(于文博等, 2017;童正飛等, 2020; 徐田軍等, 2008)。Hashimoto等(1990)成功擴(kuò)增鯉魚(yú)()的部分基因序列。目前，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物MHC研究主要集中在魚(yú)類(lèi)，對(duì)中華鱉()MHC的研究還較少。

中華鱉是我國(guó)重要的名特優(yōu)養(yǎng)殖品種之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，近年來(lái)創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益(彭娜等, 2018;陳貞年等, 2020)。目前，高度集約化養(yǎng)殖、種質(zhì)退化及抗生素濫用等導(dǎo)致中華鱉疾病頻發(fā)，治療仍主要是通過(guò)化學(xué)藥物，易導(dǎo)致水產(chǎn)品藥物殘留及產(chǎn)生抗藥性(尹夢(mèng)雅, 2018)。但關(guān)于中華鱉免疫基因的遺傳分析和抗病性研究卻相對(duì)較少。本研究利用RACE技術(shù)克隆中華鱉基因cDNA全長(zhǎng)，并以嗜水氣單胞菌()為刺激物，分析中華鱉基因在組織中的表達(dá)特征，旨在了解中華鱉免疫基因及免疫應(yīng)答，為中華鱉病害免疫防治和培育抗病新品系等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中華鱉購(gòu)自湖南河洲甲魚(yú)養(yǎng)殖基地，選取同批次、體重為100 g左右的健康中華鱉幼鱉60只，隨機(jī)分為2組，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行10只，分別飼養(yǎng)于水溫為(26±1)℃的容器中。暫養(yǎng)穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0.1 mL濃度為108CFU/mL的嗜水氣單胞菌，對(duì)照組注射0.1 mL生理鹽水。分別取注射后6 h、12 h、1 d、3 d和5 d中華鱉的肝臟、脾臟、腎臟及腸道4種組織于加有RNA保護(hù)液的1.5 mL EP管中，置于–20℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，選取健康中華鱉幼鱉3只，不做處理，分別取其肝臟、脾臟、腎臟、腸道、心臟、肌肉、腦及胃組織于1.5 mL EP管，液氮冷凍后，–80℃保存。

1.2 主要藥品與試劑

RNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)于Omega，SMARTer RACE 5′/3′ Kit、TA克隆相關(guān)試劑和TB Green Premix ExⅡ購(gòu)自大連寶生物工程(TaKaRa)公司，2×Trans-T PCR superMix (+dye) (北京全式金生物)和cDNA合成試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物合成 根據(jù)本課題組獲得的中華鱉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(MHCHX-F, MHCHX-R)，克隆獲得核心序列，并根據(jù)核心序列設(shè)計(jì)特異性引物(MHCⅡ-F, MHCⅡ-R)，進(jìn)行后續(xù)基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增，熒光定量PCR以GAPDH為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物為GAPDH-F和GAPDH-R。引物(表1)由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.3.2 RNA提取及cDNA的合成(qPCR) 采用RNA提取試劑盒(Omega)提取各組織RNA，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到各組織RNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并使用BioSpectrometer Basic核酸蛋白儀(Eppendorf)檢測(cè)其完整度、濃度及相關(guān)比值，選擇OD260 nm/280 nm值在1.8～2.0之間且條帶完整性良好的RNA用于后續(xù)cDNA的合成。

1.3.3 中華鱉基因cDNA全長(zhǎng)克隆 根據(jù)SMARTer RACE cDNA amplification kit(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)合成5′和3′末端cDNA模板，并按照要求進(jìn)行稀釋。按照說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行基因的5′或3′端序列的擴(kuò)增。PCR體系：5′或3′端cDNA模板2 μL，10×UPM引物5 μL，5′或3′端擴(kuò)增引物1 μL，ddH2O 17 μL，2×Trans-T PCR SuperMix (+dye) 25 μL。反應(yīng)均為25個(gè)循環(huán)：94℃30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min。擴(kuò)增所得目的PCR條帶用凝膠回收試劑盒回收，連接pMD18-T Vector載體后測(cè)序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 使用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果中的載體序列去除，利用DNAMAN 6.0軟件將克隆片段拼接，得到中華鱉基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析。利用ExPASy translate在線工具預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列，利用Protparam在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，利用SMART及SignalP 5.0等在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用MEGA-X軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并設(shè)置Bootstrap重復(fù)1000次，計(jì)算各分支的置信度。

1.3.5 熒光定量PCR 1.3.2中合成的cDNA稀釋5倍后，取1 μL作為熒光定量PCR模板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。GAPDH為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物采用表1中的GAPDH-F和GAPDH-R，熒光定量引物使用MHCⅡ-F和MHCⅡ-R。運(yùn)用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進(jìn)行熒光定量PCR：TB Green Premix ExⅡ(TaKaRa) 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL以及3.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)的95℃ 15 s，60℃ 20 s。采用CFX manager 3.1 (Bio-Rad)軟件收集和分析基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，并采用GraphPad Prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉MHCⅡα基因cDNA全長(zhǎng)序列分析

通過(guò)RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得了中華鱉基因cDNA全長(zhǎng)序列(圖1)，全長(zhǎng)為1296 bp (GenBank登錄號(hào): MT834970)，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?07 bp，共編碼268個(gè)氨基酸，利用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MHCⅡ氨基酸序列包括信號(hào)肽(1～37)、Ⅱ類(lèi)組織相容性抗原結(jié)構(gòu)域(44～125)、IGc1結(jié)構(gòu)域(143～ 214)及跨膜結(jié)構(gòu)域(230～252) 4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(圖2)。ProtParam tool預(yù)測(cè)MHCⅡ蛋白分子式為C1345H2081N363O385S8，分子量為29.75 kDa，等電點(diǎn)為5.67，總平均親水性(GRAVY)為–0.220。

圖1 MHCⅡα基因5′/3′RACE電泳

圖2 MHCⅡα基因cDNA全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 中華鱉MHCⅡα系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站中選取人(, CAA25142.1)、黑猩猩(, XP_003950844.1)、西部錦龜(, XP_005315098.1)、澳洲棕蛇(, XP_026577346.1)、鸮鸚鵡(, XP_030366648.1)、鵪鶉(, XP_032297688.1)、白梭吻鱸(, XP_ 031149428.1)及紅鰭東方鲀(, XP_ 029695924.1)共8種動(dòng)物的已知或預(yù)測(cè)MHCⅡ氨基酸序列，利用MEGA-X軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)中華鱉與西部錦龜屬于同一分支(圖3)，親緣關(guān)系較近。

圖3 MHCⅡα的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 中華鱉MHCⅡα的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)MHCⅡ的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，匹配的模板與MHCⅡ氨基酸序列一致度為60.67%，GMQE值為0.59，QMEAN值為–2.08，說(shuō)明MHCⅡ的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可信。

2.4 MHCⅡα mRNA組織表達(dá)分析

通過(guò)檢測(cè)mRNA在健康中華鱉不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，分析其組織表達(dá)差異。結(jié)果顯示，mRNA在中華鱉的脾、心、肝及腸組織中表達(dá)水平較高，顯著高于腎、肌肉、腦及胃組織(<0.05)，在肌肉組織中表達(dá)量最低(圖5)。

2.5 MHCⅡα mRNA的時(shí)空表達(dá)

腹腔注射嗜水氣單胞菌后，分析中華鱉的肝、脾、腸及腎組織在不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、12 h、1 d、3 d及5 d)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平(圖6)。mRNA在肝、脾、腸及腎組織中均出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。各組織mRNA相對(duì)表達(dá)量均在1 d時(shí)最高。但在脾、腸及腎3個(gè)組織的相對(duì)表達(dá)結(jié)果中有下調(diào)表達(dá)的時(shí)期，在脾的表達(dá)量在12 h及3 d時(shí)呈下調(diào)表達(dá)，在腸的表達(dá)量在3 d時(shí)呈下調(diào)表達(dá)，在腎的表達(dá)量在12 h內(nèi)呈下調(diào)趨勢(shì)以及3 d時(shí)呈下調(diào)表達(dá)。

圖4 MHCⅡα的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 MHCⅡα mRNA在不同組織中的表達(dá)分布

3 討論

基因在脊椎動(dòng)物中廣泛存在，且大多數(shù)位于同一條染色體上，具有高多態(tài)性，在免疫抗病及遺傳育種等研究中備受青睞。根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物類(lèi)型，基因目前分為、和，都由多基因座組成，但在表達(dá)組織類(lèi)型、結(jié)構(gòu)組成、刺激的T細(xì)胞類(lèi)群及多態(tài)性演化上均有差異(龐紀(jì)彩等, 2012;林友福等, 2018; Lindqvist, 2005)。類(lèi)基因被命名為，并劃分為、、等亞區(qū)(亢孝珍等, 2014)。目前，水產(chǎn)動(dòng)物基因研究已較為廣泛，大多數(shù)研究主要集中在魚(yú)類(lèi)，現(xiàn)已得到草魚(yú)()、斑馬魚(yú)()、軍曹魚(yú)()、牙鲆()、大菱鲆()等的類(lèi)基因cDNA全長(zhǎng)(van Erp, 1996; Hideki, 1992; 茅莉娜等, 2010; Prapansak, 2004; Zhang, 2006)，而關(guān)于龜鱉類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物基因的研究較少，且中華鱉基因家族尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)RACE技術(shù)成功獲得中華鱉基因cDNA全長(zhǎng)1296 bp，編碼268個(gè)氨基酸，通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)存在明顯的信號(hào)肽序列、Ⅱ類(lèi)組織相容性抗原結(jié)構(gòu)域、IGc1結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)建立氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，中華鱉基因與西部錦龜親緣關(guān)系更近，而與其他爬行類(lèi)、哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)及魚(yú)類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 細(xì)菌刺激后中華鱉MHCⅡα mRNA在肝、脾、腸及腎的表達(dá)模式

與免疫系統(tǒng)有密切關(guān)系，其編碼產(chǎn)物分布于細(xì)胞膜上，參與抗原呈遞，與水產(chǎn)動(dòng)物、家禽及哺乳動(dòng)物的遺傳多樣性、抗病性及生產(chǎn)性狀等相關(guān)(Ruan, 2016; Johannes, 2013; Zhou, 2003; 侯卓成等, 2002; Katarzyna, 2012; ?opucki, 2016; Lindqvist, 2005)。類(lèi)基因的組織表達(dá)具有差異性(Liu, 2002)。本研究熒光定量PCR結(jié)果顯示，基因在健康中華鱉所檢測(cè)的8個(gè)組織中均有表達(dá)。在中華鱉感染后，實(shí)驗(yàn)組肝臟、脾臟、腸道及腎組織mRNA的相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)，且均在1 d時(shí)達(dá)到最高。肝臟、脾臟、腸道及腎均與免疫密切相關(guān)，據(jù)此推測(cè)，中華鱉基因參與了免疫調(diào)節(jié)。

本研究首次獲得了中華鱉基因的全長(zhǎng)，并對(duì)該基因序列及結(jié)構(gòu)、所編碼的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析，構(gòu)建相關(guān)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，豐富了水產(chǎn)動(dòng)物中龜鱉類(lèi)-Ⅱ類(lèi)基因庫(kù)，為進(jìn)一步探索中華鱉基因免疫調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)，也有利于促進(jìn)中華鱉疾病防控及抗病育種的發(fā)展。

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Cloning and Expression Analysis ofcDNA in

TONG Zhengfei1, GE Lingrui1,2,3①, HU Yazhou1,3, YANG Tao1, TU Kaifa1, WANG Pei1, ZHOU Xianwen1, WANG Xiaoqing1,3①, XIONG Gang2,3

(1.410128; 2.410127; 3.,410128)

To study the structure and function of MHC (major histocompatibility complex) in, we obtained the full-length cDNA ofusing RACE-PCR (rapid amplification of cDNA ends PCR) technology. The resulting sequence was 1296 bp in length, including an ORF (open reading frame) region of 807 bp. The peptide-encodedgene could be divided into four parts, including the signal peptide, MHCⅡ alpha domain, IGc1 domain, and transmembrane region. A neighbor-joining tree showed that thegene fromandcluster into one cluster. Thegene had a close genetic-relationship withand a farther genetic-relationship with mammals, aves, and fish. Using qRT-PCR in all 8 tissues, the highest expression of thegene was observed in the spleen, heart, liver, and intestine, while the lowest level was found in muscle. Meanwhile,mRNA expression levels were significantly up-regulated in the liver and intestine (after 12 h), the spleen (on the 1st day), and the kidney (on 1st and 5th day) after being infected with. The liver, spleen, intestine, and kidney are closely related to immunity, which indicates that this gene has important effects on the immune response.

;; Sequence analysis; Gene expression

GE Lingrui, E-mail: 84805349@qq.com; WANG Xiaoqing, E-mail: wangxiao8258@126.com

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0102-07

10.19663/j.issn2095-9869.20200802001

http://www.yykxjz.cn/

童正飛, 葛玲瑞, 胡亞洲, 楊濤, 涂開(kāi)發(fā), 王佩, 周先文, 王曉清, 熊鋼. 中華鱉基因cDNA的克隆及組織表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 102–108

TONG Z F, GE L R, HU Y Z, YANG T, TU K F, WANG P, ZHOU X W, WANG X Q, XIONG G. Cloning and expression analysis ofcDNA in. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 102–108

葛玲瑞，副教授，E-mail: 84805349@qq.com；王曉清，教授，E-mail: wangxiao8258@126.com

2020-08-02,

2020-08-16

*國(guó)家重點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)項(xiàng)目–藍(lán)色糧倉(cāng)(2018YFD0900200)、湖南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(2018JJ3265)、國(guó)家自然科學(xué)基金(31672640)和湖南省教育廳資助科研項(xiàng)目(18C0170)共同資助 [This work was funded by Key National and Special Project of Blue Granary Science and Technology Innovation (2018YFD0900200), Youth Fund Project of Natural Science Foundation of Hunan Province (2018JJ3265), National Natural Science Foundation of China (31672640), and Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department (18C0170)]. 童正飛，E-mail: 1101142532@qq.com

(編輯 馮小花)