宋紅梅 周康奇 田 雪 汪學杰 劉 超 劉 奕 牟希東 胡隱昌

橘色雙冠麗魚黑色素細胞和黃色素細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定*

宋紅梅1周康奇2田 雪3汪學杰1劉 超1劉 奕1牟希東1胡隱昌1①

(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業(yè)農村部休閑漁業(yè)重點實驗室 廣東省現代休閑漁業(yè)工程技術研究中心 廣東 廣州 510380；2. 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室 重慶 402460; 3. 河南師范大學水產學院 河南省水產動物養(yǎng)殖工程技術研究中心 河南 新鄉(xiāng) 453007)

為探討橘色雙冠麗魚()黑色素細胞和黃色素細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定方法，觀察魚類色素細胞生長特征，本研究以橘色雙冠麗魚的尾鰭、鱗片、皮膚組織為材料，在25℃～28℃條件下，分別在胰蛋白酶溶液和膠原酶溶液中消化6h和12h，可有效分離出色素細胞團，細胞懸液經氣孔尼龍網過濾后，于35%-45%-55% Percoll試劑中梯度分離和收集黃色素細胞和黑色素細胞。采用K-SFM培養(yǎng)基進行細胞原代培養(yǎng)和細胞純化，抑制成纖維細胞和角朊細胞的生長，用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、雙抗、bFGF的DMEM培養(yǎng)基進行色素細胞傳代培養(yǎng)；運用巴染色和透射電鏡觀察細胞形態(tài)，并用分子標記技術進行細胞鑒定。結果顯示，細胞分離時，黑色素細胞位于Percoll試劑45%和35%濃度層之間，黃色素細胞位于Percoll試劑35%濃度層上，2種色素細胞均凝聚成絮狀。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現，黑色素細胞內部含大量黑色素小體，而黃色素細胞內部含喋呤體和類胡蘿卜素囊泡；黑色素細胞左旋多巴(L-DOPA)染色呈陽性；取第10代色素細胞進行體色相關基因黑皮素1受體(melanocortin receptor 1,)、酪氨酸酶(tyrosinase,)和()PCR檢測，顯示基因擴增條帶特異性強，表明獲得的2種色素細胞具有良好的生物學活性。本研究建立了橘色雙冠麗魚黃色素細胞和黑色素細胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法，為進一步開展魚類體色細胞分化和體色形成的分子機理研究提供了細胞模型。

橘色雙冠麗魚；色素細胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

體色是魚類獨特的表型和經濟性狀(Sk?ld, 2013)，尤其對于觀賞魚類，體色和斑紋直接決定其觀賞價值和市場價值。魚類體色繁雜多樣、五彩斑斕，深入認識魚類體色形成的調控機制，尋求人工改良魚類體色的有效途徑，是一個非常值得探索的課題。魚類體色的形成和維持受到一系列細胞、基因和生理因素的復雜調控(Colihueque, 2010)，其體色構成不僅與色素合成有關，更取決于皮膚、鱗片和鰭條所含色素細胞的種類、數量、分布及色素細胞之間的相互作用(Inaba, 2012)。色素細胞是魚類體色形成的基本單位和重要載體，目前，已報道魚類至少有黃色素細胞(xanthophores)、紅色素細胞(erythrophores)、虹彩細胞(iridophores)、白色素細胞(leucophores)、黑色素細胞(melanophores)、藍色素細胞(cyanophores)和紫紅色素細胞(erythro-iridophores) 7種不同的色素細胞(徐偉等, 2007; Goda, 2011; Inaba, 2012; Singh, 2015)。

成功分離和體外培養(yǎng)色素細胞是探究動物體色相關基因生物學功能的基礎，也是了解魚類體色形成和體色變異分子機理的前提(Gola, 2012; Shigeki, 2011)。Eisinger等(1982)通過0.25%胰酶消化處理人包皮組織后，通過添加十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)和霍亂毒素(CT)首次成功分離和體外培養(yǎng)了人的黑色素細胞；Tamura等(1987)通過人胚胎提取物和TPA，成功從小鼠皮膚獲得黑色素細胞。此后，研究者也相繼在其他動物皮膚中成功分離黑色素細胞，如羊駝()(白瑞等, 2013)、烏骨雞()(田穎剛等, 2014)、狐() (鮑加榮, 2015)。但鮮見魚類色素細胞分離培養(yǎng)的相關報道。本研究在參考之前哺乳動物等色素細胞提取研究的基礎上，以具有典型體色褪色過程(黑色–灰色–亮黃色)的橘色雙冠麗魚()為實驗對象，構建魚類體表黑色素細胞和黃色素細胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法，旨在為魚類體色基因功能研究提供細胞模型，為利用體外培養(yǎng)色素細胞進行魚類色素細胞分化和體色形成機理的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用橘色雙冠麗魚采自中國水產科學研究院珠江水產研究所觀賞漁業(yè)研究基地，挑選健碩無傷的魚暫養(yǎng)，黑色時期平均體長為(5.0±0.5) cm，黃色時期平均體長為(7.0±0.5) cm，保證日常投喂和正常光照，控制適宜的養(yǎng)殖水溫(23℃～28℃)和充足的溶氧。

1.2 主要試劑

K-SFM培養(yǎng)基、DMEM basic (1×)培養(yǎng)基、bFGF (堿性成纖維細胞生長因子)、大豆胰蛋白抑制劑均購自Gibco (美國)；胰蛋白酶(Typsin 1∶250 for biochemistry)、EDTA(乙二胺四乙酸)、TPA、DNaseⅠ(脫氧核糖核酸酶Ⅰ)、99%胎牛血清(FBS)、膠原酶Ⅰ(CollageⅠ)、DMSO(二甲基亞砜)均購自Sigma公司(美國)；左旋多巴(L-DOPA)均購自MCE(美國)；牛血清蛋白、Percoll溶液購自Invitrogen公司(美國)；新潔爾滅(利爾康，山東)；PBS緩沖液、SSC雜交緩沖液(海利克思，上海)；RNA提取試劑盒Total RNA kitⅡ購自OMEGA公司(美國)；反轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA synthesis kit購自TaKaRa (日本)；雙抗原液(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)購自中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所；其他常規(guī)藥品購自廣州康龍生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織的消化處理與色素細胞分離 取所需魚鰓放血致死，用0.1%新潔爾滅洗魚體3次，再用75%酒精消毒魚全身。常溫下取所需魚尾鰭、皮膚、鱗片組織，將采集的組織剪碎至1 mm3大小的塊狀，轉入50 mL離心管中，加入胰蛋白酶溶液40～45 mL，混勻，25℃～28℃下消化6～8 h。棄胰蛋白酶溶液，用1×PBS在1000 r/min離心沖洗5 min，重復5次，去除表皮組織碎塊。加入膠原酶溶液混勻，25℃～28℃下消化12～15 h。轉入25 μm氣孔尼龍網過濾分裂組織，放置5 min，800 r/min離心8 min，過濾得液體。吸取2 mL細胞溶液樣品，置于Percoll分層試劑(濃度梯度為55%-45%-35%)，1000 r/min離心20～25 min，使色素細胞分離于不同濃度層。

1.2.2 色素細胞的培養(yǎng)、純化與傳代 將分離的色素細胞懸液轉移至KCl細胞培養(yǎng)基中，吹打均勻，取1滴溶液接種于5mL KCl培養(yǎng)基的25mL不透氣培養(yǎng)瓶中，置于28℃培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，并放入一杯水，保證培養(yǎng)箱內的濕度。

每3 h觀察原代細胞生長情況，原代細胞長至約90%時，去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化，消化后去酶液，加入KC培養(yǎng)基純化細胞，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，獲得純化的色素細胞。

純化過的基礎原代細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時，加入MC2培養(yǎng)基，將細胞重懸，進行細胞傳代。即在新25 mL不透氣培養(yǎng)瓶中加入MC2培養(yǎng)基5mL，加入1滴純化過的細胞，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對2～3代細胞進行形態(tài)學觀察比較。

1.2.3 色素細胞的顯微觀察鑒定 參考常用黑色素細胞的DOPA染色法(Wang, 2013)，分別取第3代生長旺盛的2種色素細胞各15mL，加入4%多聚甲醛固定10 min，用1×PBS洗滌3次，加入0.1% L-DOPA溶液，孵育4 h，2 h換液1次，制作細胞爬片，鑒定色素細胞的活性和生長情況。

再各取第3代生長旺盛的2種色素細胞15 mL，1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入1.5 mL 4%戊二醛固定液固定，保存于4℃。在JEM-1400PLUS型透射電子顯微鏡(日本HITACHI)下觀察拍照，分析色素細胞的形態(tài)結構。

1.2.4 色素細胞體色相關基因PCR鑒定 分別取第10代生長旺盛的2種色素細胞，用Total RNA KitⅡ(OMEGA)提取RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)合成得到cDNA。

根據從NCBI的GenBank數據庫中搜索與橘色雙冠麗魚序列及相關同源物種的基因，采用Primer Premier 6.0進行PCR引物設計(表1)，引物由廣州艾基生物技術有限公司合成。以2種色素細胞提取RNA反轉錄的cDNA為模板，利用3對引物分別進行PCR擴增，反應體系(50 μL)：ddH2O 32.5μL，10×buffer 5 μL，dNTPs 8μL，模板cDNA (200 ng/μL) 2 μL，酶0.5 μL，正反向引物(10μmol/L)各1 μL。PCR參數：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，退火60 s (退火溫度見表1)，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min。電泳檢測擴增結果。

表1 實驗所用引物

2 結果

2.1 橘色雙冠麗魚色素細胞分離、培養(yǎng)和觀察

2.1.1 色素細胞提取 以2個典型褪色時期“黑色期和黃色期”橘色雙冠麗魚為材料，提取獲得的2種色素細胞均保持原有顏色(圖1A)。通過Percoll試劑55%-45%-35%濃度梯度離心分層，黑色素細胞位于梯度層的45%～35%之間(圖1B箭頭b所指)，而黃色素細胞位于35%濃度層上(圖1B箭頭a所指)。取2種色素置于同一Percoll濃度梯度試劑離心，2種色素細胞均能明顯分離和分層，黑色素細胞在下層(圖1C箭頭b所指)，位于45%～35%之間，黃色素細胞位于35%濃度層表面(圖1C箭頭a所指)。

圖1 橘色雙冠麗魚色素細胞分離

2.1.2 分離培養(yǎng)后色素細胞形態(tài)學比較觀察 初步分離的2種色素細胞均凝聚呈絮狀，形態(tài)觀察發(fā)現，絮狀物各自分布了大量黑色素細胞和黃色素細胞(圖2A、2B)；低倍鏡下觀察培養(yǎng)的第1代色素細胞，發(fā)現黑色素細胞呈球狀，有零星色素顆粒散落出細胞外(圖2C)，而黃色素色素細胞全部為單個色素個體，分布在培養(yǎng)基表面。黃色素細胞在培養(yǎng)前期，細胞小，單個不聚攏(圖2D、2E)；經過培養(yǎng)，細胞迅速生長，6～12 h覆蓋培養(yǎng)基表面約70%后細胞個體變大，慢慢聚攏；過夜培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)基表面約90%時，大個體色素細胞聚攏(圖2F)，與在鱗片上直接觀察到的色素細胞形狀大小基本一致。

2.1.3 橘色雙冠麗魚體表色素細胞形態(tài)學觀察 為與分離培養(yǎng)的色素細胞形態(tài)進行對比，分別從橘色雙冠麗魚“黑色–灰色–黃色”體色過渡期魚體上取下背部鱗片進行色素細胞觀察，發(fā)現黑色魚體上的色素細胞占絕大比例，黑色素細胞單個成簇狀，有分散和聚攏2種形態(tài)(圖3A)。灰色魚體上色素細胞數量少，個體小，有黑色和黃色色素同時存在，黑色素細胞顏色較黑色魚體鱗片上的淺，為棕色，細胞個體也較小；出現的黃色素細胞為彌散狀，分布于黑色素細胞下層，色素細胞不顯現完整清晰的形狀(圖3B)。黃色魚體上基本無黑色素細胞，有數量較多、個體較大的黃色素細胞，有的細胞顏色較深且偏紅，呈凝聚狀，類似于紅色素細胞(圖3C)。

圖2 橘色雙冠麗魚色素細胞培養(yǎng)后形態(tài)學觀察

圖3 橘色雙冠麗魚鱗片色素細胞

2.2 2種色素細胞的顯微觀察與生物學鑒定

2.2.1 L-DOPA染色鑒定黑色素細胞酶的活性 取第3代生長旺盛的黑色素細胞進行L-DOPA染色，在顯微鏡下觀察黑素細胞染色情況，可見斑點狀黑色或灰色黑色素細胞，L-DOPA染色呈陽性(圖4B)。黃色素細胞沒有多巴染色，還未見黃色素細胞酶活性的方法，只能從顯微鏡下觀察其生長情況。

2.2.2 透射電鏡分析 通過透射電鏡觀察黑色素細胞，可見其內部含大量的黑色素小體(圖5A)。電鏡下，觀察到黃色素細胞內部的喋呤體(圖5箭頭所指a)和類胡蘿卜素囊泡(圖5箭頭所指b)，細胞內部結構完整。

2.2.3 2種色素細胞和基因的PCR檢測 第10代生長旺盛的黑色素細胞和黃色素細胞和的PCR檢測結果顯示，擴增條帶特異性良好(圖6)，說明獲得的黑色素細胞和黃色素細胞均保持著較好的生物活性。

圖4 橘色雙冠麗魚黑色素細胞的L-DOPA染色

圖5 電鏡觀察黑色素細胞和黃色素細胞的顯微結構

3 分析與討論

在細胞分離培養(yǎng)中，運用不同消化酶對組織進行消化處理是影響細胞提取效果的重要因素，在常用的幾種組織消化酶中，DispaseⅡ酶對皮膚組織消化相對較弱，多應用于哺乳動物眼睛黑色素細胞的分離培養(yǎng)(鮑加榮, 2015)；中性蛋白酶可選擇性作用于纖維蛋白、黏連蛋白和Ⅳ型膠原，破環(huán)板橋內的結構，但對于橋粒結構作用卻很少，很難將表皮完全分散；胰蛋白酶能水解細胞間質中的蛋白質，破環(huán)細胞間的半橋粒和橋粒結構，從而使細胞分散；膠原酶Ⅰ作用于結締組織中的膠原蛋白，對細胞間質產生消化作用，且對細胞本身影響不大，能使細胞保持高活力(田穎剛等, 2014; 鮑加榮, 2015)。本研究參考Inaba等(2012)的方法并改進，在25℃～28℃下用2.5 mg/mL的胰蛋白酶消化組織6～8 h，去除表皮細胞，再用0.1 mg/mL膠原酶Ⅰ配制的溶液進行二次消化12～15 h，可分離獲得活性較高的色素細胞原液。分離的2種色素細胞在Percoll梯度試劑中低速離心后分層明顯，細胞層間隔35%的Percoll試劑層，推測黑色素細胞較黃色素細胞質量重，確定2種色素細胞分離時所在Percoll試劑濃度層，可為下一步實驗得到培養(yǎng)純化細胞奠定基礎。

圖6 色素細胞中TYR、EDNRB和MC1R基因的PCR片段擴增

色素細胞體外培養(yǎng)一般采用K-SFM角朊細胞培養(yǎng)基、DMEM、M199等，比較K-SFM和DMEM/F12 2種培養(yǎng)基對羊駝毛囊干細胞生長和增殖的影響，發(fā)現K-SFM培養(yǎng)基更有利于毛囊干細胞增殖，培養(yǎng)出的細胞數量多、增殖快，克隆生成能力更強(弓慧敏等, 2016)。田穎剛等(2014)以K-SFM培養(yǎng)基為原代培養(yǎng)和細胞純化，以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng)，成功建立烏骨雞黑色素細胞系。本研究借鑒哺乳動物和鳥類(Deveci, 2001)的培養(yǎng)方法加以改進，采用能抑制成纖維細胞和角朊細胞生長的K-SFM培養(yǎng)基進行細胞原代培養(yǎng)和細胞純化，以DMEM培養(yǎng)基為最終傳代培養(yǎng)，獲得生理狀態(tài)良好的色素細胞。

魚類的鱗片、皮膚和尾鰭有很多膠原纖維細胞和角質細胞，數量遠遠大于黑色素細胞和黃色素細胞，因此，色素細胞培養(yǎng)中，雜細胞的去除非常關鍵，培養(yǎng)基中添加促癌因子TPA可對不同細胞產生選擇性毒性作用。TPA能促進色素細胞分泌特定的生長因子，促進細胞的生長、粘附和增殖，抑制成纖維細胞及角質形成，達到避免成纖維細胞和膠質污染，從而獲得純化的色素細胞(Yaar, 1991)。因此，本研究在原代培養(yǎng)和細胞純化時，增大TPA用量(10 ng/mL)，但傳代培養(yǎng)時，應減少TPA用量(1 ng/mL)，以減少對2種色素細胞的毒性作用。

本研究在鱗片上直接觀察到的黑、黃2種色素細胞個體分明，成群地分布在鱗片上，而提取到的2種色素細胞在低倍鏡下觀察呈絮狀，但也能看到一些單個的色素細胞，為判定所提取的色素細胞有無破裂、有無增殖能力及生物活性狀況等，對色素細胞進行培養(yǎng)后顯微觀察，發(fā)現2種色素細胞均能正常生長，其中，黃色素細胞迅速生長，細胞個體變大后，慢慢聚攏成球狀。通過多巴染色和透射電鏡來觀察黑色素小體是鑒定黑色素細胞的經典方法(Deveci, 2001; Fuller, 2001; Hu, 2007)。多巴染色培養(yǎng)的黑色素細胞呈現陽性反應，高倍透射電鏡觀察黑色素細胞內部結構，顯現大量黑色素小體；黃色素細胞內部可見喋呤體和類胡蘿卜素囊泡，2種色素細胞內部結構與在大麻哈魚(Walbaum)皮膚表面通過電鏡觀察到的狀態(tài)相似(Djurdjevi?, 2015)，佐證本研究所建立的提取、分離和體外培養(yǎng)橘色雙冠麗魚體表黑、黃2種色素細胞方法的可行性。

魚類體色的分布和形成主要由表現為黑色、棕色表型的真黑色素和表現為黃色、紅色表型的褐黑色素2種黑色素的相對數量及分布決定，二者均源于黑色素合成信號通路，都在酪氨酸基因()的調控下表達(Lin, 2007; 王成輝, 2012)。而基因和基因在黑色素合成通路中起著類似于“開關”的作用(Adalsteinsson, 1987; 蔣燕玲等, 2016)。在色素細胞發(fā)育中，基因能促進神經嵴細胞的增殖，調節(jié)神經嵴細胞分化為色素細胞(Parichy, 2000)。因此，本研究從黑、黃2種色素細胞中提取總RNA，檢測色素細胞中體色關鍵基因和的表達，發(fā)現均能擴增出特異性條帶，表明獲得的黑色素細胞和黃色素細胞具有良好的生物學狀態(tài)。

本研究利用Percoll梯度試劑分離橘色雙冠麗魚黑色素細胞和黃色素細胞，以K-SFM培養(yǎng)基(添加10 ng/mL TPA)進行原代和純化培養(yǎng)，最后培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，并添加1 ng/mL TPA、20 ng/mL bFGF和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，建立了2種色素細胞的培養(yǎng)體系，并利用形態(tài)觀察、多巴染色、透射電鏡觀察和體色相關基因表達對培養(yǎng)細胞的特性進行研究，為進一步構建橘色雙冠麗魚黑色素細胞和黃色素細胞系奠定基礎，為了解魚類色素細胞發(fā)育、體色形成及相關基因功能等提供參考。

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Isolation, Culture and Identification of Polychromatic Midas cichlids () Melanophores and Xanthophores

SONG Hongmei1, ZHOU Kangqi2, TIAN Xue3, WANG Xuejie1, LIU Chao1, LIU Yi1, MU Xidong1, HU Yinchang1①

(1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Leisure Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Guangdong Modern Leisure Fisheries Engineering Technology Research Center, Guangzhou, Guangdong 510380, China; 2. China Southwest University, Key Laboratory of Freshwater Fish Resources and Reproductive Development, Ministry of the Ministry of Education, Chongqing 402460, China; 3. College of Fisheries, Engineering Technology Research Center of Henan Province for Aquatic Animal Cultivation, Henan Normal University, Xinxiang, Henan 453007, China)

This study aimed to investigate the methods of isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores in polychromatic midas cichlids () and to thus observe the growth characteristics of pigment cells in fish. In this study, the caudal fin, scales, and skin tissues ofwere used as the experimental material. To separate the pigment cells, the tissues were digested in trypsin solution and collagenase solution for 6 h and 12 h, respectively,at 25℃～28℃. After the cell suspension was filtered through a stoma nylon net, xanthophores and melanocytes were separated and collected by means of 35%-45%-55% Percoll multilayer density gradient centrifugation. K-SFM medium was used for primary cell culture and cell purification to inhibit the growth of fibroblasts and keratinocytes. DMEM supplemented with phorbol ester (TPA), double resistance, and bEGF,., was used for the subculture of pigment cells. The morphology of the cells was observed by L-DOPA staining and transmission electron microscopy, and the cells were identified by molecular markers. The results showed that when the cells were separated, the melanocytes were located at the boundary of the 45% and 35% Percoll reagent layers, while xanthophores were located on top of the 35% Percoll layer. Both pigment cells condensed into flocculation. Transmission electron microscopy showed that the melanocytes contained a large number of melanosomes, while the yellow cells contained the MTX and carotenoid vesicles. The melanocytes were positive under L-DOPA staining. The 10th generation of pigment cells was used for PCR detection of the body color related genes,, and, which showed strong specificity of gene amplification bands, indicating that the two pigment cells obtained had good biological activity.In this study, methods for the isolation, culture, and identification of melanophores and xanthophores of polychromatic midas cichlids were successfully established, providing a cell model for further research on the molecular mechanisms of body color cell differentiation and body color formation in fish.

; Pigment cell; Separation; Cultivation; Identification

HU Yinchang, E-mail: huyc22@163.com

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0053-08

10.19663/j.issn2095-9869.20200617001

http://www.yykxjz.cn/

宋紅梅, 周康奇, 田雪, 汪學杰, 劉超, 劉奕, 牟希東, 胡隱昌. 橘色雙冠麗魚黑色素細胞和黃色素細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定. 漁業(yè)科學進展, 2021, 42(6): 53–60

SONG H M, ZHOU K Q, TIAN X, WANG X J, LIU C, LIU Y, MU X D, HU Y H. Isolation, culture and identification of polychromatic midas cichlids () melanophores and xanthophores. Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 53–60

胡隱昌，研究員，E-mail: huyc22@163.com

2020-06-17,

2020-08-20

*國家自然科學基金青年基金(802037)、廣東省自然科學基金(2020A1515010304)和廣州市科技計劃項目(202002030047)共同資助[This work was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (802037),(2020A1515010304), and(202002030047)]. 宋紅梅，E-mail: shm1227@126.com

(編輯 馮小花)