曾夢妮 李 磊 馬麗艷 王翠華 張 璇 黃冬梅 蔣 玫

菲在厚殼貽貝體內(nèi)的富集與釋放及其對HSP70 mRNA表達的影響*

曾夢妮1,2李 磊2馬麗艷2王翠華2張 璇2黃冬梅2蔣 玫2①

(1. 上海海洋大學海洋生態(tài)與環(huán)境學院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海 200090)

以厚殼貽貝()為研究對象，開展不同暴露濃度(4、20和100 μg/L)菲(phenanthrene, PHE)的富集(10 d)和釋放(5 d)實驗，分別利用高效液相色譜法和熒光定量qPCR法分析了厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜、閉殼肌對PHE的富集和釋放實驗及HSP70 mRNA表達量的變化。結(jié)果顯示，在10 d的富集階段，厚殼貽貝3個組織對PHE的富集能力大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團>外套膜>閉殼肌；3個組織對PHE的富集含量隨時間的增加而增加，同時，也隨暴露濃度的增加而增加；在釋放實驗階段，厚殼貽貝3個組織中PHE含量在釋放前期迅速下降，但在15 d時，3個組織中PHE殘留量仍均高于對照組；PHE對厚殼貽貝體內(nèi)HSP70 mRNA誘導表達具有組織特異性，其中外套膜中HSP70 mRNA表達量最高。研究結(jié)果可為PHE在貝類體內(nèi)的富集動力學及致毒機制研究提供參考依據(jù)。

菲；厚殼貽貝；生物富集；HSP70

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是由2個及2個以上的苯環(huán)以稠環(huán)或非稠環(huán)的形式相互連接成的有機化合物，其主要通過高分子有機化合物的不完全燃燒而產(chǎn)生(賈雙琳等, 2020)。研究證明，PAHs具有致癌性、致突變性和致畸性，可以通過食物鏈作用在生物體內(nèi)累積，對環(huán)境造成嚴重污染的同時，也對人類的健康產(chǎn)生危害(楊帆等, 2013; Zheng, 2016; Yin, 2017)。

16種優(yōu)控多環(huán)芳烴一直受到廣泛關注，其中，菲(phenanthrene, PHE)是具有代表性的低分子量多環(huán)芳烴，是水生生態(tài)系統(tǒng)中含量最豐富的一種(Shirmohammadi, 2017)，通常作為研究PAHs的模型(Rabodonirina, 2019; Sun, 2019a)。PHE的化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有較強的疏水性，常吸附在水中的沉積物和懸浮顆粒上，在水體中可長距離遷移(Gu, 2016)。PHE對水生動物包括貝類、魚類、水生昆蟲等都具有潛在的毒性(武江越等, 2018)。李磊等(2015)、Yakan等(2013)、Mokkongpai等(2010)和Keshavarzifard等(2017)分別研

究了PHE在縊蟶()、地中海貽貝()、青口貝()、短頸蛤()等體內(nèi)的富集動力學特征，均表明PHE在貝類體內(nèi)有較強的富集能力，但關于比較單一多環(huán)芳烴在貝類不同組織富集及釋放的特性和差異性的研究不多。PHE對水生生物基因表達也會產(chǎn)生影響，Peng等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，PHE對斑馬魚()雌魚下丘腦–垂體–性腺軸的GnRH2和CYP11A1等基因的轉(zhuǎn)錄造成了明顯的特異性改變，對斑馬魚繁殖造成不利的影響。Piazza等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，圓吻扇貝()暴露在PHE水溶液中，其體內(nèi)CYP2UI、CYP2D20和CYP3A11等基因的轉(zhuǎn)錄水平增加。Karami等(2016)將非洲鯰()幼仔三倍體暴露于76 mg/L PHE濃度水溶液中；結(jié)果顯示，魚體1()的mRNA水平增加。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類應激蛋白，其中，HSP70是研究比較深入的一種HSPs，參與到各種保護機體和細胞機制中，通常作為環(huán)境應激和毒性的生物標志物(許高鵬等, 2015; Mayer, 2005; Voisine, 1999)。研究表明，HSP70在有機體受到環(huán)境、生理或病理脅迫時會被誘導表達(曲凌云, 2004; 周朝偉等, 2018; Sun, 2019b)。目前，已有許多學者選擇貝類完成對水體中有機物的富集及對貝類基因影響的研究，楊丹丹等(2019)利用高效液相色譜法檢測厚殼貽貝()體內(nèi)16種PAHs的含量。Murray等(1991)通過田間實驗測定紫貽貝()中PAHs的生物富集因子。王淑紅等(2005)研究了翡翠貽貝外套膜、鰓、內(nèi)臟團對16種PAHs的蓄積特征。劉娜(2012)研究了菲律賓蛤仔()在苯并[a]芘脅迫下3種(芳烴受體蛋白、芳烴受體核轉(zhuǎn)位因子和熱休克蛋白90)基因表達分析。盧瑋筱(2018)研究了在苯并[a]芘刺激下厚殼貽貝組織中RACK1基因的表達。

海洋雙殼貝類分布廣泛，營固著生活，是濾食性動物，對水體中有機污染物的積累性強，常作為監(jiān)測海洋環(huán)境污染的指示生物。目前，關于貝類組織對PAHs蓄積規(guī)律的研究多集中于各組織對總PAHs的蓄積含量比較，如劉童(2015)比較了菲律賓蛤仔消化盲囊、鰓、閉殼肌、軟體部對PAHs的蓄積含量規(guī)律。李天云等(2007)比較了河蜆()鰓、內(nèi)臟團、肌肉對PAHs的蓄積含量關系。關于貝類體內(nèi)HSP70 mRNA誘導表達的研究，其研究的誘導因子多為鹽度、溫度、重金屬等，如Franzellitti等(2005)分別研究了熱休克和汞對地中海貽貝體內(nèi)HSP70 mRNA表達的影響，而對于單一多環(huán)芳烴PHE在貝類組織的蓄積規(guī)律研究以及PHE對貝類不同組織HSP70 mRNA表達影響的研究較少。

本研究選擇厚殼貽貝為對象，通過對厚殼貽貝進行在不同濃度PHE溶液中的富集–釋放實驗，獲得厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜及閉殼肌對PHE的富集和釋放規(guī)律及HSP70 mRNA表達影響，為PHE在貝類體內(nèi)的富集動力學及致毒機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗海水為海水晶人工配制的海水，鹽度為26，水溫為(23±2)℃。厚殼貽貝為浙江省枸杞島采集的人工養(yǎng)殖厚殼貽貝，平均殼長為(84.6±5.2) cm，殼寬為(40.9±2.5) cm，體重為(40.2±6.2) g。實驗前將厚殼貽貝暫養(yǎng)7 d，期間連續(xù)充氣，并投喂螺旋藻粉后選取健康個體進行實驗，實驗容器容積為20 L的玻璃缸體，裝入海水14 L。

1.2 PHE的富集和釋放

1.2.1 富集和釋放實驗 實驗分為富集和清水恢復2個階段，分別進行10 d和5 d。以丙酮作為助溶劑，在預實驗的基礎上設置PHE分別為4、20、100 μg/L的實驗組和人工海水對照組(加入0.01%丙酮)，每組設3個平行。每組放入16只厚殼貽貝，每24 h換水1次，換水率100%，晝夜充氣，每天定時投喂螺旋藻粉。分別于1、3、6、10、12和15 d隨機取2只厚殼貽貝，分離其內(nèi)臟團、外套膜、閉殼肌組織于–80℃保存，待檢測分析。

1.2.2 組織中的PHE含量測定 分別測定厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌中的PHE含量，測定步驟如下：稱取5.0 g濕樣加入5 mL超純水混合振搖，再加入15 mL乙腈劇烈振搖，以100 Hz 30℃超聲5 min后加入1.5 g無水乙酸鈉和6.0 g無水硫酸鎂劇烈振搖，以4000 r/min離心5 min，取上清液；先用5 mL乙腈預淋洗Florisil/C18層析柱，再移取5 mL上清液通過層析柱過濾，再用15 mL乙腈繼續(xù)洗脫，收集全部流出液于梨形瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約0.5 mL，用乙腈定容至1 mL，13,000 r/min離心6 min，上清液過濾膜，移至進樣瓶中，供高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件 Thermo SCIENTIFIC HYPERSIL Green PAH色譜柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm)；柱溫位30℃；進樣量為25 μL；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長為245 nm；50%乙腈梯度洗脫。配制濃度分別為5、25、50、125和250 ng/mL的PHE標準液，繪制標準曲線。

1.3 HSP70 mRNA實驗方法

1.3.1 樣本準備及總RNA提取 每個實驗組取50 mg的厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌加入1 mL Trizol，使用勻漿器進行勻漿處理；轉(zhuǎn)移至RNase-free的離心管中，進行RNA的抽提。室溫放置5 min，向離心管中加入預冷的氯仿(200 μL氯仿/1 mL Trizol)，劇烈振蕩15 s，室溫放置10 min，離心(4℃，12,000 r/min) 15 min；小心析出上層水相約500 μL，轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，加入等體積(500 μL)的異丙醇，顛倒混勻6～8次，–20℃冰箱放置30 min；再以10,000 r/min低溫離心15 min，可見RNA沉淀；棄上清液，加入650 μL 75%乙醇(75%乙醇的配制：1倍的DEPC處理水加3倍的無水乙醇)洗滌沉淀，8000 r/min低溫離心5 min，棄上清液；重復上個步驟1遍，棄上清液，吸凈殘存乙醇，自然干燥5～10 min；加入適量的RNase-free H2O溶解RNA，–20℃冰箱，保存，待用。實驗過程中，采用核酸蛋白測定儀檢測RNA的純度和濃度，以保證總RNA純度較高、完整性較好，可直接用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量的研究。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 采用第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系，0.2 mL PCR管中加入以下試劑，混勻逆轉(zhuǎn)錄反應體系(總RNA、Random Primer p(dN)6、Rnase-free ddH2O、Reaction Buffer、dNTP Mix、Rnase inhibitor、AMV Reverse Transcriptase) (Thermo, #K1622)后37℃溫浴5 min；再以42℃溫浴60 min，最后70℃溫浴10 min，終止反應。

1.3.3 Real-time PCR擴增 根據(jù)Real-time PCR反應體系配制反應液。在PCR反應管中分別加入ddH2O、SybrGreen qPCR Master Mix(Thermo, F-415XL)、Forward primer、Reverse primer、cDNA模板，充分混勻；反應體系按照表1配制。擴增條件：94℃10 min, (94℃20 s，55℃20 s，72℃20 s) 40個循環(huán)。

表1 熒光定量PCR分析基因表達所用到的引物

1.4 樣品檢測方法

1.4.1 標準曲線和回收率 用乙腈稀釋PHE標準溶液，配制濃度分別為5、25、50、125和250 ng/mL的標準溶液，經(jīng)1.2.3的色譜條件進行測定。PHE在0.2～20.0 ng/mL范圍內(nèi)，標準曲線線性回歸方程為=1.405 7+0.443 8，相關系數(shù)=0.999 6；以信噪比S/N=3，求得PHE檢出限為0.1 μg/kg。

檢測貽貝體內(nèi)PHE含量為(4.040 3±0.596 0) μg/kg，用加標后測得的含量扣除本底值，計算得平均回收率為103.03%，RSD為5.6%，符合本實驗方法要求。

1.4.2 2–??Ct法 Real-time PCR數(shù)據(jù)處理采用2–??Ct法分析目的基因在對照組和各濃度組之間的表達差異，計算公式如下：?=目的基因–內(nèi)參，再求得對照組?對照平均，用各組的?分別減去?對照，求得??值，即??=?樣本–?對照平均，再計算各組2–??Ct值，即為各組中基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學處理，使用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan′s多重比較判斷組間差異的顯著性，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮作為助溶劑的可行性

為了驗證0.01%丙酮作為PHE的助溶劑的可行性，在實驗過程中，對PHE的對照組和0.01%丙酮處理組中貽貝3種組織的PHE含量進行統(tǒng)計學檢驗。結(jié)果表明，對照組貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌的PHE含量分別為(4.43±0.48)、(3.89±0.32)和(3.79±0.23) μg/kg，0.01%丙酮處理組貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌的PHE含量分別為(4.43±0.54)、(3.97±0.27)和(3.92±0.22) μg/kg，二者相比無顯著性差異(>0.05)，說明0.01%丙酮作為PHE的助溶劑是可行的。

2.2 厚殼貽貝3種組織對PHE的富集和釋放規(guī)律

厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌在4、20和 100 μg/L PHE海水溶液中對PHE的富集和釋放情況如圖1、圖2和圖3所示。厚殼貽貝3個組織對PHE的吸收速率和釋放速率如表2所示。在厚殼貽貝對PHE的富集階段，內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌中PHE富集量隨時間的增加而增加。同時，也隨PHE暴露濃度的增加而增加。內(nèi)臟團在1、3、6和10 d時，3個濃度組之間PHE含量變化呈顯著增加(<0.05)。

圖1 貽貝內(nèi)臟團對PHE的富集和釋放情況

圖2 貽貝外套膜對PHE的富集和釋放情況

外套膜在1 d時，4和20 μg/L濃度組PHE含量無顯著差異(>0.05)；在3 d時，3個濃度組PHE含量無顯著差異(>0.05)；在6和10 d時，3個濃度組PHE含量呈顯著增加的趨勢(<0.05)。閉殼肌在1、3、6和10 d時，20和100 μg/L濃度組PHE含量無顯著差異(>0.05)，同時，4 μg/L濃度組PHE含量呈顯著增加的趨勢(<0.05)。厚殼貽貝3個組織對PHE的富集含量和富集速度表現(xiàn)為內(nèi)臟團>外套膜>閉殼肌。

圖3 貽貝閉殼肌對PHE的富集和釋放情況

在5 d的釋放階段，厚殼貽貝3個組織對PHE的釋放速率規(guī)律不同。其中，內(nèi)臟團對PHE的釋放速率隨暴露濃度變化不大，外套膜對PHE的釋放速率隨暴露濃度的增加而降低，閉殼肌對PHE的釋放速率隨暴露濃度的增加而升高。內(nèi)臟團PHE釋放速率分別為58.72% (4 μg/L)、50.71%(20 μg/L)和54.60% (100 μg/L)；外套膜PHE釋放速率分別為72.82% (4 μg/L)、68.35% (20 μg/L)和38.65% (100 μg/L)；閉殼肌PHE釋放速率分別為56.41% (4 μg/L)、58.35% (20 μg/L)和66.11% (100 μg/L)。在釋放前期，厚殼貽貝3個組織內(nèi)的PHE含量急劇下降，在清水恢復的第4、5天，3個組織內(nèi)PHE濃度釋放速度減慢。

2.3 PHE誘導厚殼貽貝3種組織中HSP70 mRNA的表達分析

暴露在PHE濃度溶液中厚殼貽貝3種組織HSP70 mRNA水平變化如圖4、圖5和圖6所示。厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌中HSP70 mRNA的表達均有變化。在富集階段，厚殼貽貝外套膜HSP70 mRNA表達量明顯高于內(nèi)臟團和閉殼肌，其中，在PHE低、中和高濃度溶液暴露下，外套膜中HSP70 mRNA表達量均在第1天時達到最高值，分別是對照組的35.7倍 (4 μg/L)、47.8倍(20 μg/L)和70.1倍(100 μg/L)；內(nèi)臟團中HSP70 mRNA表達量分別在第3、6和1天時達到最高值，分別是對照組的26.3倍(4 μg/L)、10.9倍 (20 μg/L)和23倍(100 μg/L)；閉殼肌中HSP70 mRNA表達量分別在第3、1和6天時達到最高值，分別是對照組的2.8倍(4 μg/L)、3.2倍(20 μg/L)和3.5倍 (100 μg/L)。

表2 厚殼貽貝3個組織對PHE的吸收速率和釋放速率

圖4 菲暴露及釋放下厚殼貽貝內(nèi)臟團中HSP70的相對表達量

圖5 菲暴露及釋放下厚殼貽貝外套膜中HSP70的相對表達量

圖6 菲暴露及釋放下厚殼貽貝閉殼肌中HSP70的相對表達量

厚殼貽貝在PHE的整個富集釋放過程中，3個組織中HSP70 mRNA表達量的變化規(guī)律各不相同。從圖4可以看出，3個濃度PHE對厚殼貽貝內(nèi)臟團中HSP70 mRNA誘導表達，4 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著增加(<0.05)；在3 d時，HSP70 mRNA表達量達到最高值；隨后隨著時間增加，HSP70 mRNA表達量逐漸降低。20 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著增加(<0.05)；在3 d時，HSP70 mRNA表達量降低且較對照組無顯著差異(>0.05)；在6 d時，HSP70 mRNA表達量達到最高值；后隨時間的增加，HSP70 mRNA表達量逐漸降低。100 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量為最高值；隨后隨時間的增加，HSP70 mRNA表達量逐漸降低，但都較對照組顯著增加(<0.05)。

從圖5可以看出，3個濃度PHE對厚殼貽貝外套膜HSP70 mRNA誘導表達，4、20和100 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組呈極顯著增加(<0.01)；在3 d時，各濃度組HSP70 mRNA表達量達到最高值；隨后隨時間的增加，各濃度組HSP70 mRNA表達量逐漸降低，但都較對照組顯著增加(<0.05)。

3個濃度PHE對厚殼貽貝閉殼肌HSP70 mRNA誘導表達情況見圖6。4 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著增加(<0.05)；在3 d時HSP70 mRNA表達量達到最高值；后隨時間的增加，HSP70 mRNA表達量逐漸降低，在10和12 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著降低(<0.05)，呈抑制表達狀態(tài)；在15 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組無顯著差異(>0.05)。20 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量達最高值；后隨時間增加，HSP70 mRNA表達量逐漸降低，直至第6天時，HSP70 mRNA表達量達最低值；之后HSP70 mRNA表達量又隨時間的增加而增加。100 μg/L濃度組在1 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著增加(<0.05)；在3 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組無顯著差異(>0.05)；在6 d時，HSP70 mRNA表達量增加至最高值；在10和12 d時，HSP70表達量較對照組無顯著差異(>0.05)；在15 d時，HSP70 mRNA表達量較對照組顯著增加(<0.05)。

3 討論

3.1 厚殼貽貝3種組織對PHE的富集和釋放規(guī)律

PHE作為低分子量PAHs的典型代表，在水中溶解度較大，且具有高親脂性、易滲透生物膜、在水生生物體內(nèi)快速富集的特點(Ademollo, 2017)。本研究表明，在同一時間、同一暴露濃度下，厚殼貽貝3個組織對PHE的富集含量規(guī)律為內(nèi)臟團>外套膜>閉殼肌。3個組織對PHE的富集含量隨時間的增加而增加，同時，也隨PHE暴露濃度的增加而增加。其原因主要有以下幾個，首先，PHE自身具有較高的正辛醇/水分配系數(shù)，脂溶性較強，實驗中使用丙酮作為助溶劑，提高了PHE的生物利用性，使PHE通過細胞的被動擴散作用與脂肪組織相結(jié)合，提高了厚殼貽貝的富集作用；其次，厚殼貽貝主要是通過過濾海水攝食，海水在經(jīng)過鰓的過濾后，較大顆粒物質(zhì)沉淀在外套膜上，較小顆粒物質(zhì)進入內(nèi)臟團的消化器 (王淑紅等, 2005)。本研究中，PHE隨水流進入厚殼貽貝各組織并迅速溶于脂肪，由于PHE具有脂溶性，易在各組織中累積；最后，PAHs在生物組織內(nèi)的累積程度與脂肪含量有關，脂肪含量高的組織更容易富集PAHs (Wang, 2011)。貝類各濕樣組織脂肪含量比較，內(nèi)臟團的脂肪含量最大(楊慧贊, 2008)。外套膜作為與水體直接接觸的組織，能吸附或吸收水體中的PHE。因此，比閉殼肌富集PHE的含量要高，這與宮向紅等(2017)報道PAHs在海灣扇貝不同組織中富集規(guī)律一致。

當厚殼貽貝開始處于清水釋放狀態(tài)時，各組織對PHE的釋放主要受控于熱力學驅(qū)動的擴散、酶系統(tǒng)調(diào)控的新陳代謝活動和排泄作用(Baussant, 2001)，這2種作用使厚殼貽貝各組織內(nèi)的PHE含量在釋放階段前期開始迅速降低，隨著釋放時間的延長，厚殼貽貝各組織內(nèi)PHE含量逐漸降低，經(jīng)過5 d的釋放，厚殼貽貝內(nèi)臟團PHE釋放速率在50%～60%之間，外套膜PHE釋放速率隨暴露濃度的升高逐漸降低，閉殼肌PHE釋放速率隨暴露濃度的升高逐漸升高，這與組織特異性有關。與外套膜、閉殼肌相比，內(nèi)臟團中存在大量酶系參與PHE的代謝過程，使3個濃度組內(nèi)臟團的釋放速率相差不大；而外套膜中PHE的排出則主要是通過血細胞滲出，這種作用相對酶的作用來說較弱，導致外套膜中PHE的釋放速率隨暴露濃度升高逐漸降低。

3.2 PHE誘導厚殼貽貝3種組織中HSP70 mRNA的表達分析

熱休克蛋白70 (HSP70)是一類應激蛋白，常在細胞受到外界環(huán)境脅迫時應激表達，與許多信號轉(zhuǎn)導途徑的關鍵調(diào)節(jié)因子相互作用，控制細胞的穩(wěn)態(tài)、增殖、分化和細胞死亡(Mayer, 2005)。從本研究可以看出，3個組織HSP70 mRNA表達的劑-效關系隨時間變化規(guī)律不同。本研究中，在PHE暴露初期，厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌HSP70 mRNA表達量都較對照組顯著增加，這是由于機體受到PHE脅迫時，為防止細胞內(nèi)蛋白凝聚或變性，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，HSP70 mRNA被誘導表達來增強機體抗刺激及生存能力。隨著暴露在PHE水溶液中時間的增加，厚殼貽貝體內(nèi)對PHE的富集量逐漸增加，內(nèi)臟團、外套膜及閉殼肌中HSP70 mRNA表達量在1、3或6 d時達到最高值，這可能是因為不同組織其HSP70 mRNA表達具有差異性。內(nèi)臟團和外套膜中HSP70 mRNA表達量達最高值后，HSP70 mRNA表達量開始逐漸降低，可能是由于細胞中PHE濃度超過閾值時，機體細胞的生物合成能力遭到破壞，HSP70 mRNA的表達量將會降低或者被抑制，說明熱休克蛋白70的表達對細胞的保護是有一定范圍的(Eckwert, 1997)。這與荊圓圓等(2019)研究不同鹽度下，鎘對太平洋牡蠣()不同組織HSP70 mRNA表達影響結(jié)果一致。而閉殼肌中，HSP70 mRNA在6、10和12 d受到抑制表達后，在第15天時仍能恢復正常表達量，這可能是因為閉殼肌中，HSP70 mRNA表達量隨PHE含量降低至一定值后，將不受抑制表達。由于HSP70 mRNA在厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌中是組成性表達(程培周等, 2007)，PHE對厚殼貽貝3個組織中HSP70誘導表達量高低排序為外套膜>內(nèi)臟團>閉殼肌。

4 結(jié)論

在富集階段，厚殼貽貝3個組織對PHE的富集能力大小表現(xiàn)為內(nèi)臟團>外套膜>閉殼肌。同時，3個組織對PHE的富集含量隨時間的增加而增加，也隨PHE暴露濃度的增加而增加。在清水恢復前期，厚殼貽貝3個組織中PHE含量迅速下降；在第15天時，厚殼貽貝內(nèi)臟團3個濃度組PHE釋放速率在50%～ 60%之間，外套膜PHE釋放速率隨暴露濃度的升高逐漸降低，閉殼肌PHE釋放速率隨暴露濃度的升高逐漸升高。PHE對厚殼貽貝內(nèi)臟團、外套膜和閉殼肌的HSP70 mRNA誘導表達具有組織特異性，其中，外套膜中HSP70 mRNA表達量最高。

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Enrichment and Release of Phenanthrene in Mussels () and Its Effect on HSP70 mRNA Expression

ZENG Mengni1,2, LI Lei2, MA Liyan2, WANG Cuihua2, ZHANG Xuan2, HUANG Dongmei2, JIANG Mei2①

(1. School of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. East China Sea Fisheries Research Institute, Shanghai 200090, China)

Phenanthrene (PHE) is one of the most abundant polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aquatic ecosystems. It has strong hydrophobicity and is often adsorbed on sediment and suspended particles in water, which has potential toxicity to aquatic organisms. Mussels () are widely distributed in the ocean and live in a fixed environment. They are filter feeders and have a strong accumulation of organic pollutants in water. They are often used as indicator organisms in monitoring marine environmental pollution. In this study, enrichment (10 d) and release (5 d) tests of PHE with different exposure concentrations were carried out. Three groups of PHE (4 μg/L, 20 μg/L, and 100 μg/L) and artificial seawater group (control group: 0.01% acetone) were set up. Three parallel experimental replicates were set up in each group, and 16 mussels were placed in each group. Two mussels were randomly selected on the 1st, 3rd, 6th, 10th, 12th, and 15th day. Their visceral mass, outer membrane, and closed shell muscle tissue were separated and stored at –80℃ for identification and analysis. Enrichment and release of PHE and the change in HSP70 gene expression in visceral mass, outer membrane, and closed shell muscle tissue were analyzed using HPLC and qPCR, respectively. Results showed that the concentration of PHE in the three tissues of mussels was in this order: visceral mass > outer membrane > closed shell muscle at the same time and concentration. The enrichment content of PHE in the three tissues increased with an increase in time and concentration, owing to the higher-octanol/water partition coefficient and fat solubility of PHE, filter feeding life of mussels, and the fact that tissues with high fat content are more likely to enrich PHE. For the release test, the PHE content in the three tissues of mussels decreased rapidly in the early stage of release; however, on the 15th day, the residual amount of PHE in the three tissues was still higher than that in the control group. This is because the release of PHE in different tissues was mainly controlled by diffusion driven by thermodynamics, metabolic activity regulated by enzyme system, and excretion when mussels were in the state of water release. In addition, PHE content in mussel tissues began to decrease rapidly in the early stage of release and gradually decreased with the extension of release time. Furthermore, HSP70 was induced to enhance the anti-stimulation and survival ability of the organism under PHE stress; the expression of HSP70 mRNA in mussels was tissue-specific, and the expression level of HSP70 in the outer membrane was the highest. These results provide a reference for the study of enrichment kinetics and toxic mechanisms of PHE in shellfish.

Phenanthrene;; Bioconcentration; HSP70

JIANG Mei, E-mail: jiangrose73@163.com

S968

A

2095-9869(2021)06-0093-09

10.19663/j.issn2095-9869.20200811002

http://www.yykxjz.cn/

曾夢妮, 李磊, 馬麗艷, 王翠華, 張璇, 黃冬梅, 蔣玫. 菲在厚殼貽貝體內(nèi)的富集與釋放及其對HSP70 mRNA表達的影響. 漁業(yè)科學進展, 2021, 42(6): 93–101

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蔣 玫，研究員，E-mail: jiangrose73@163.com

2020-08-11,

2020-09-07

*國家重點研發(fā)科技計劃項目(2017YFC1600705)、中央公益科研機構(gòu)基礎研究基金(2020TD14)和國家貝類產(chǎn)業(yè)體系建設項目(CARS-49)共同資助[This work was supported by National Key Research and Development Project (2017YFC1600705), the Earmarked Fund for CARS (CARS-49), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD14)].曾夢妮，E-mail: 2731238959@qq.com

(編輯 陳 輝)