江昊薇，易晴晴，沈丹杰，高紅昌，趙良才

溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

乳酸作為一種能量分子，在學習記憶形成的過程中發(fā)揮著重要作用[1]。但是，因病理因素導致的乳酸蓄積，即乳酸不能被神經(jīng)元氧化利用可能是學習記憶下降的重要因素[2-3]。成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21, FGF21）通過其受體參與糖脂代謝，并能夠穿過血腦屏障直接在中樞系統(tǒng)發(fā)揮作用[4-6]。有研究報道，F(xiàn)GF21具有增加乳酸進入神經(jīng)元的作用，因而改善了阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）小鼠認知功能障礙[7]。本研究擬采用乳酸蓄積誘導的學習記憶下降的小鼠模型，給予FGF21進行干預治療，應用基于核磁共振的代謝組學技術篩選海馬中的特征代謝物。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑 6周齡雄性C57BL/6小鼠（體質量18～22 g）購自上海斯萊克實驗動物有限公司。所有動物均飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房，整個實驗過程給小鼠喂食標準鼠糧和水，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0020。乳酸鈉購自美國Sigma公司（批號：BCCB9288）。FGF21購自浙江省生物制藥工程重點實驗室（批號：STD20190601）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模：小鼠適應性飼養(yǎng)1周以后分成3組，分別為對照組、乳酸組及乳酸+FGF21組（每組各8只）。乳酸組和乳酸+FGF21組小鼠每日腹腔注射乳酸（1.5 g/kg）共持續(xù)8周，乳酸+FGF21組小鼠在乳酸給藥第4周時每天腹腔注射FGF21藥物（1.5 mg/kg）[8]，對照組腹腔注射同等體積的0.9%氯化鈉溶液。8周后所有動物進行水迷宮和Y迷宮實驗。

1.2.2 Y迷宮實驗：Y迷宮是由木板拼接成的Y字形，三條臂從中心延伸，臂與臂間呈120°夾角。將三條臂分別用A、B、C標記。實驗時將小鼠放入迷宮一條臂的末端，允許在迷宮中不受外界干擾自由移動探索5 min，記錄小鼠的運動軌跡包括進入各臂的順序及總次數(shù)。當小鼠連續(xù)3次進入不同的臂時，記作1次正確交替反應，統(tǒng)計正確交替反應次數(shù)，計算自發(fā)交替率[9-10]。

1.2.3 水迷宮實驗：Morris水迷宮用于評估小鼠的空間學習和記憶能力。采用文獻[7]的方法，水迷宮測試在圓形水池中進行（池徑110 cm，池高30 cm），水池內注滿無毒性白色涂料，其溫度為（26±1）℃。包含圓形逃生平臺（平臺直徑為7 cm）浸沒在水面下方1 cm。將小鼠分別按順序放入池內4個象限并被迫尋求隱藏的逃生平臺，進行連續(xù)4 d的培訓。如果小鼠無法在60 s內到達逃生平臺，則操作員將引導它們到此平臺。在第5天，移除逃生平臺，將培訓的小鼠在單個探針跟蹤中測試90 s。使用頂置攝像機來記錄小鼠的行為，使用含有Viewer2軟件（德國Biobserve GmbH公司）的計算機系統(tǒng)記錄小鼠的游泳軌跡、穿過逃避平臺的次數(shù)、游泳總路程，綜合分析這些數(shù)據(jù)來評價3組小鼠的學習記憶能力。

1.2.4 海馬組織樣本制備與處理：小鼠行為學測試結束后，麻醉狀態(tài)下處死。冰上分離得到小鼠海馬組織，并立即冷凍在液氮中然后轉移到-80 ℃冰箱保存。將冰凍的海馬組織稱重后，加入冰甲醇（4 mL/g）和冰蒸餾水（0.85 mL/g）。使用組織勻漿機勻漿后，加入冰氯仿（2 mL/g）和冰蒸餾水。冰上靜置15 min后，4 ℃、12 000×g離心15 min。取上清液，然后轉移到NMR樣品管中進行核磁共振氫譜（nuclear magnetic resonance,1H NMR）檢測。

1.2.51H NMR采集和分析：通過使用Bruker 600-MHz AVANCE III核磁共振譜儀采集腦組織1H NMR圖譜，采用飽和ZGPR標準脈沖序列。具體參數(shù)：數(shù)據(jù)采集點，64 K；豫池延遲，2 s；譜寬度，12 000 Hz；采集時間，2.66 s。所有核磁共振波譜均采用Topspin 3.0軟件（德國Bruker BioSpin公司），手動校正相位/基線。使用MATLAB軟件（美國MathWorks公司）執(zhí)行icoshift程序對齊所有的核磁譜峰。圖譜區(qū)域為0～10.0 ppm，不包含4.7～5.0ppm的殘余水峰信號及3.35～3.36 ppm甲醇信號峰。按照間隔0.01 ppm距離分段進行多元模式識別分析。然后使用SIMCA-P 12.0軟件包（瑞典UMetrics公司）對歸一化的積分值進行多變量模式識別或定量分析，通過兩個主成分的得分圖（t[1]和t[2]）來觀察數(shù)據(jù)，其中每個點的位置代表一個樣本。

1.2.6 實時熒光定量PCR實驗：根據(jù)RNA提取方案，將小鼠海馬（10～20 mg）在TRIzol試劑（CA、卡爾斯巴德）中裂解勻漿，提取總RNA。隨后將RNA反轉錄成cDNA。在CFX96 Real-Time PCR（Bio Rad）模塊上完成PCR檢測。本研究檢測了與學習記憶功能相關的突觸可塑性基因的mRNA水平，包括早期生長反應-1（early growth response-1, EGR-1）、原癌基因（proto-oncogene, c-Fos）、突觸前蛋白（presynaptic, SYP）和突觸后蛋白（postsynaptic proteins, PSD，包括PSD-93、PSD-95）。相關引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR采用的引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FGF21改善乳酸蓄積誘導的小鼠學習記憶下降趨勢 Y迷宮結果發(fā)現(xiàn)3組小鼠總穿臂次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），運動能力沒有明顯差異，3組間的自發(fā)交替率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），乳酸組較對照組的自發(fā)交替率明顯下降，給予FGF21后其自發(fā)交替率較乳酸組明顯升高（P＜0.05）。見圖1A、圖1B。Y迷宮結束后，對其進行5 d的水迷宮實驗，結果顯示與對照組相比，乳酸組的逃避潛伏期明顯變長，而給予FGF21治療后其逃避潛伏期較乳酸組明顯降低（P＜0.05），且第4天趨近于對照組（見圖1C）。第5天撤去平臺觀察小鼠的穿臺次數(shù)，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，乳酸組的穿臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05），給予FGF21后穿臺次數(shù)明顯多于乳酸組（見圖1D、圖1E、圖1F）。

圖1 各組小鼠Y迷宮、水迷宮的實驗結果

2.2 FGF21改善長期乳酸蓄積引起的突觸可塑性基因表達的下降 與小鼠學習記憶功能相關的突觸可塑性基因的mRNA檢測結果表明，相比對照組，乳酸組的SYP、EGR-1、c-Fos、PSD95、PSD93的mRNA水平明顯降低，而給予FGF21治療后得到了較明顯改善（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠c-Fos、PSD95、PSD93、EGR-1、SYP的mRNA表達變化

2.3 FGF21重塑乳酸蓄積誘導的小鼠海馬腦區(qū)的代謝紊亂

2.3.1 小鼠海馬代謝物1H-NMR譜圖歸屬：歸屬出的代謝物有肌醇、甘氨酸、?；撬?、磷酸膽堿、膽堿、肌酸、甲基甘氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、谷氨酰胺、琥珀酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸、乙酸、丙氨酸、乳酸、3-羥基丁酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、肌苷、富馬酸、AMP、IMP（見圖3）。

圖3 小鼠海馬組織的1H-NMR圖譜

2.3.2 小鼠海馬PLS-DA模式分析結果：各組小鼠海馬間出現(xiàn)了較明顯區(qū)分，乳酸組代謝模式偏離對照組，乳酸+FGF21組代謝模式趨近于對照組（見圖4）。采用OPLS-DA進行兩組之間差異代謝的比較，發(fā)現(xiàn)對照組與乳酸組、乳酸組與乳酸+FGF21組、對照組與乳酸+FGF21組海馬樣本的OPLS-DA得分圖出現(xiàn)了明顯區(qū)分，表明兩兩比較的各自代謝差異比較明顯。同時也對它們的VIP圖進行分析，VIP值越大的代謝物其對代謝模式影響越大，發(fā)現(xiàn)乳酸、N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸、肌酸、?；撬嵋约凹〈嫉呢暙I較大。見圖5。

圖4 3組小鼠海馬組織OPLS-DA代謝模式分析圖

圖5 3組小鼠OPLS-DA得分圖和對應的VIP得分圖

2.3.3 小鼠海馬部分代謝物定量分析結果：乳酸組小鼠海馬中乳酸的含量較對照組顯著升高，給予FGF21后其含量明顯恢復（P＜0.05）。而?；撬帷⒓≤?、肌酸、肌醇、谷胱甘肽、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、琥珀酸、N-乙酰天冬門氨酸、天冬氨酸、一磷酸腺苷、肌苷酸等在乳酸組中較對照組明顯降低，給予FGF21后其含量均明顯上升（P＜0.05），見圖6。

圖6 3組小鼠海馬組織的代謝物定量分析圖

3 討論

先前研究表明，在衰老、糖尿病、AD等疾病中學習記憶都有不同程度的損傷，而且往往伴隨著腦中乳酸的異常升高[11-12]。持續(xù)的乳酸積累會導致海馬中神經(jīng)功能受損[3]，因此乳酸的蓄積可能與學習記憶下降有關。本研究采用長期乳酸處理的小鼠模擬乳酸蓄積模型，并給予FGF21進行治療，運用動物行為學、分子生物學和代謝組學技術分析FGF21是否改善乳酸積蓄引發(fā)的小鼠學習記憶下降趨勢和作用機制。

在連續(xù)給予乳酸8周后，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，表征空間學習記憶的行為學指標降低，海馬區(qū)突觸可塑性基因包括c-Fos、PSD95、PSD93、EGR-1、SYP的mRNA水平均降低，而給予FGF21治療后其行為學及突觸可塑性基因水平都得了改善。以上研究表明，長期乳酸暴露的小鼠出現(xiàn)了學習記憶力下降，而給予FGF21后小鼠的學習記憶明顯恢復。

長期注射乳酸后，代謝組學結果提示了海馬乳酸含量的升高，提示了神經(jīng)元對乳酸利用的下降。除此之外，相對于對照組，能量相關代謝物包括琥珀酸、富馬酸、一磷酸腺苷、肌苷酸、肌酸、肌苷等明顯降低，給予FGF21后它們的含量都明顯恢復。同時，抗氧化類代謝物如?；撬?、谷胱甘肽等在乳酸處理后明顯降低，給予FGF21后其含量顯著上升。

星型膠質細胞-神經(jīng)元乳酸穿梭學說認為，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內星型膠質細胞和神經(jīng)元之間存在乳酸的轉運過程，即星型膠質細胞主要產生乳酸，然后通過單羧酸轉運體（monocarboxylte transporters, MCT）蛋白釋放乳酸，后者被神經(jīng)元利用進入三羧酸循環(huán)產生能量物質[13-15]，該過程與學習記憶密切相關。本研究中，長期暴露乳酸后，腦中乳酸的蓄積很可能與神經(jīng)元中MCT2蛋白的活性下降有關。有研究報道在AD動物模型中，F(xiàn)GF21可以通過增加MCT2的表達促進神經(jīng)元的乳酸攝取，通過調控乳酸脫氫酶-B的表達促進乳酸生成丙酮酸，因而改善認知功能障礙[7]。在研究中也發(fā)現(xiàn)FGF21給藥后乳酸含量的下降，提示了FGF21可能促進乳酸利用的增加，因而增強海馬能量物質的合成。

在腦內，能量代謝物可以維持離子梯度和神經(jīng)遞質的攝取，因而對維持大腦功能十分重要，包括學習記憶功能[16]。本研究通過代謝組學分析發(fā)現(xiàn)乳酸組小鼠的一磷酸腺苷、肌苷酸、肌酸、肌苷、琥珀酸等呈現(xiàn)下降趨勢，而FGF21可以明顯恢復這些代謝物的水平，進一步說明FGF21可以通過調控能量代謝來改善小鼠的學習記憶障礙。因此FGF21可能通過促進乳酸被神經(jīng)元所吸收利用，因而治療小鼠的學習記憶功能障礙。

當乳酸進入細胞后，生成丙酮酸等能量物質的同時伴有NADH/NAD+的變化，后者參與了氧化還原的平衡過程。有研究報道乳酸對學習記憶的調控作用是NADH/NAD+依賴性的谷氨酸受體活性介導，這涉及突觸可塑性相關基因，如EGR-1、ARC和c-FOS[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)乳酸組中?；撬?、谷胱甘肽含量明顯降低，給予FGF21后它們的含量有所恢復。谷胱甘肽是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸生物合成的，是細胞中豐富的氧化還原分子，它具有重要的抗氧化作用[19-20]。此外?；撬嵋彩且环N與氧化損傷、內質網(wǎng)應激和細胞凋亡有關的抗氧化劑[21-22]。以上提示了FGF21通過調控NADH/NAD+的氧化應激過程，因而調控學習記憶功能。

綜上所述，乳酸在腦中的蓄積會引起小鼠認知功能障礙，其機制是神經(jīng)元能量代謝下降，或者是NADH依賴的氧化應激的產生（見圖7）。而FGF21可能通過促進乳酸的利用，恢復神經(jīng)元的能量代謝以及氧化應激機制從而改善學習記憶功能，本研究也為FGF21在糖尿病認知功能障礙、AD等疾病中的臨床應用提供了可能性。

圖7 乳酸轉化成丙酮酸相關代謝途徑