楊兵兵，魏 哲，藺思函，李倩倩，李 博，王春丹，沈秀麗，杜志強*

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 包頭014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)圖書館，內(nèi)蒙古自治區(qū) 包頭014010）

0 引言

【研究意義】小龍蝦是一種淡水甲殼類無脊椎動物，學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），原產(chǎn)于墨西哥北部與美國南部。目前，它在我國已經(jīng)成為了一種重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖密度的增加、病原菌引起的蝦病頻繁爆發(fā)，給小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。因此，研究小龍蝦抗細(xì)菌先天免疫，對于蝦病防治策略的制定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】無脊椎動物為了保護機體免受外界病原侵染，進化出了一套先天免疫防御機制[1]。作為甲殼類模式動物，小龍蝦主要依靠自身的先天免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的入侵[2]，該系統(tǒng)包括物理屏障、體液免疫與細(xì)胞免疫三部分[3]。對于體液免疫而言，主要的效應(yīng)分子是抗菌肽，包括對蝦素、溶菌酶、甲殼肽、抗脂多糖因子等，相關(guān)研究結(jié)果顯示：此類分子對細(xì)菌、真菌具有廣泛的抑菌活性，因而在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域被廣泛關(guān)注[4,5]。近些年，在紅螯蝦（Pacifastacus leniusculus）、凡納繽對蝦（Litopenaeus vannamei）、中華絨螯蝦（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的抗菌先天免疫相關(guān)研究中，相繼發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的甲殼肽分子[6?9]。在分子結(jié)構(gòu)方面，抗菌肽分子的N末端極性氨基酸的殘基促使其分子具有活化劑的活性性質(zhì)[10]。在作用機理方面，抗菌肽分子能夠與病原菌細(xì)胞壁表面的正負(fù)電荷進行結(jié)合，使其表面產(chǎn)生穿孔，內(nèi)溶物釋放，從而造成病原菌的死亡[11,12]，發(fā)揮抑菌活性。張財亮等利用LPS、Poly I:C刺激擬穴青蟹，并且通過對鰓組織中crustin基因進行抗細(xì)菌的研究[13]。【本研究的切入點】小龍蝦在鯰愛德華氏菌刺激后組織甲殼肽基因表達(dá)模式有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過qRT-PCR技術(shù)分析小龍蝦在鯰愛德華氏菌刺激后的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸組織基因相對表達(dá)量。通過對小龍蝦crustin6甲殼肽基因的研究以及初步解決后續(xù)基因重組表達(dá)、抗體制備、功能研究的技術(shù)問題，為深入無脊椎動物抗細(xì)菌先天免疫基礎(chǔ)理論研究提供理論依據(jù)，同時也為水生生物養(yǎng)殖實踐環(huán)節(jié)中免疫策略的制定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

健康的小龍蝦（15～20 g），購買自包頭市友誼瑞福海鮮市場；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，賽默飛世爾科技公司；動物總RNA提取試劑盒（TRIzol）、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光染料TB Green Prem ix，寶生物（大連）有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取無菌條件下采集小龍蝦的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸組織、肌肉50～100 mg置于玻璃勻漿器中，加入1m L預(yù)冷的TRIzol試劑進行勻漿，使用動物總RNA提取試劑盒提取上述各組織的總RNA，利用NANO Drop2000儀進行濃度測定，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量鑒定。

1.2.2 cDNA合成提取的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明進行cDNA合成，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量驗證并且?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因序列的PCR擴增根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析而獲得的一段小龍蝦甲殼肽基因的中心序列，設(shè)計目的基因序列擴增引物Pc-crustin-F（5′-GCT CCA GCG TAC ACG CAA-3′）與Pc-crustin-R（5′-ATG GCT CCC GGT GAT GGC-3′），以制備的小龍蝦肝胰腺cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)，擴增目的基因序列片段。PCR反應(yīng)條件：①95℃，預(yù) 變 性3min；②95℃，變性30 s；③55℃，退火30 s；④72℃，延伸45 s（35個循環(huán)）；⑤72℃，后延伸5m in。

1.2.4 重組載體的構(gòu)建與序列測定以制備的小龍蝦肝胰腺cDNA為模板，以上述Pc-crustin-F、Pccrustin-R為引物進行PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分離、純化目的基因擴增片段，根據(jù)T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒的使用方法，將目的基因擴增片段與pUCm-T載體連接，構(gòu)建重組載體并進行陽性重組子篩選，之后委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 氨基酸序列比對將測序獲得的目的基因序列在NCBI在線網(wǎng)站的BLASTx模塊中進行序列比對，選擇相似度較高的crustin基因序列，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對分析。

1.3.2 系統(tǒng)進化樹分析根據(jù)BLASTx序列比對結(jié)果，將物種親緣關(guān)系較近、基因序列相似度較高的crustin基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.4 多組織表達(dá)譜分析

在小龍蝦第二腹節(jié)處注射鯰愛德華氏菌（2×107CFU）進行刺激（鯰愛德華氏菌本實驗室?80℃冰箱保存），對照組注射PBS，并在0、2、6、12、24、36、48 h解剖取樣（血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸），每個時間點平均取3只樣，提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測小龍蝦crustin基因mRNA的正常組織分布與鯰愛德華氏菌刺激后的基因表達(dá)模式。其中，目的基因特異性擴增引物為Pc-crustin-RT-F（5′-CAC TAT GGC TTC TAC GGTC-3′）與Pc-crustin-RT-R（5′-CTG GAG GCT GTG CAG GAA G-3′），18S RNA內(nèi)參基因的擴增引物為18S RNA-RT-F（5′-TCT TCT TAG AGG GAT TAG CGG-3′）和18S RNA-RT-R（5′-AAG GGG ATT GAA CGG GTTA-3′）。PCR擴 增 程 序 如 下：95℃，30 s循環(huán)1次；95℃，5 s，60℃，34 s循環(huán)40次。從刺激開始進行3次重復(fù)之后，采用2?ΔCT算法統(tǒng)計分析目的基因的正常組織分布，利用2?ΔΔCT算法統(tǒng)計分析鯰愛德華氏菌刺激后的基因表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增結(jié)果

PCR擴增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。結(jié)果顯示：在DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量250-500 bp之間有一條明亮的條帶，與理論值465 bp相符合，表明PCR擴增結(jié)果正確（圖1）。

圖1 Pc-crustin 6基因PCR擴增后的電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis of Pc-crustin 6 after PCR am p lification

2.2 序列分析結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)過BLASTx比對，并且根據(jù)已有小龍蝦crustin甲殼肽基因的同源序列數(shù)目，將其命名為Pc-crustin6甲殼肽基因。序列分析結(jié)果顯示：Pccrustin6的cDNA序列全長為465 bp，開 放 閱 讀 框（ORF）包括384 bp，編碼127個氨基酸殘基；其中，N末端25個氨基酸是信號肽序列，C末端的47個氨基酸形成了一個抗菌肽分子特有的WAP結(jié)構(gòu)域，其中存在8個保守的Cys殘基（圖2）。

圖2 Pc-crustin 6的cDNA序列以及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA and encoded am ino acidssequencesof Pc-crustin 6

2.3 氨基酸序列比對結(jié)果

利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示：小龍蝦Pc-Crustin 6甲殼肽分子與巴西美對蝦Fb-Crustin分子的同源性為28.49%，與圣保羅對蝦Fp-Crustin分子的同源性為28.33%，與南美藍(lán)對蝦Ls-Crustin分子的同源性為28.81%，與日本對蝦Pj-Crustin 3分子的同源性為26.53%，與小褐美對蝦Fs-Crustin分子具有最高同源性，為29.19%（圖3）。

圖3 Pc-crustin 6與其他物種crustin基因的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.3 Am ino acids sequence alignment between Pc-crustin 6 and other crustin s

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示：小龍蝦Pc-Crustin 6分子與小褐美對蝦Fs-Crustin分子、南美藍(lán)對蝦Ls-Crustin分子、巴西美對蝦Fb-Crustin分子、圣保羅對蝦Fp-Crustin分子、斑節(jié)對蝦Pm-Crustin 1分子分布在進化樹的同一分支（圖4），表明它們之間的親緣關(guān)系較近。

圖4 Pc-Crustin 6分子與其他Crustin分子親緣關(guān)系的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis on relationshipsbetween Pc-Crustin 6 and other Crustin s

2.5 分子結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果

利用EXPASY軟件預(yù)測目的蛋白質(zhì)分子的初級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：該分子中包括一個完整的WAP結(jié)構(gòu)域，是一個典型的Crustin甲殼肽分子。

2.6 目的基因的組織分布分析

利 用qRT-PCR技 術(shù) 檢 測Pc-crustin6在 小 龍蝦5個組織中的表達(dá)水平，并且以18S RNA作為內(nèi)參基因。圖5結(jié)果顯示：Pc-crustin6在血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸和肌肉中均有表達(dá)，并且，在鰓組織中的表達(dá)量最高，其次是血細(xì)胞與腸組織，其他組織中的表達(dá)量較低。

圖5 Pc-crustin 6基因的多組織表達(dá)譜分析Fig.5 Expressionsof Pc-crustin 6 in various tissuesof P. clarkia

2.7 細(xì)菌刺激后Pc-crustin 6的表達(dá)模式

利用qRT-PCR技術(shù)檢測Pc-crustin6在鯰愛德華氏菌刺激后的表達(dá)模式，以18S RNA作為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示：圖6中A、B、C、D分別代表血細(xì)胞、肝胰腺、鰓和腸組織中Pc-crustin6在鯰愛德華氏菌刺激后的表達(dá)模式，可以看出：細(xì)菌刺激后，Pc-crustin6在上述4個組織中的表達(dá)量均呈現(xiàn)出了明顯的上調(diào)趨勢，說明其與對抗細(xì)菌刺激有關(guān)。

圖6 鯰愛德華氏菌刺激后Pc-crustin 6的表達(dá)模式Fig.6 Pc-crustin 6 expressions after E. ictaluri stimu lation

3 討論

近幾年的相關(guān)研究結(jié)果表明抗菌肽是甲殼類動物先天免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)分子。例如，賈文明對獲得的Crustin 1-4甲殼肽分子的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其N端均具有一個信號肽序列[14]，這是此類分子的典型特征之一。王一麗對日本沼蝦中的Crustin 1-13甲殼肽分子進行序列分析，發(fā)現(xiàn)這13個甲殼肽分子也具有典型的Crustins家族的分子結(jié)構(gòu)特征[15]，在分子C末端存在至少8個保守的Cys殘基。孫晨[16]對中國明對蝦的Crustin 2與Crustin 3分子的研究發(fā)現(xiàn)WAP結(jié)構(gòu)域是甲殼肽分子的功能結(jié)構(gòu)域。王慧[17]從擬穴青蟹中克隆得到的Crustin 2分子的N端含有信號肽序列，C端具有Cys殘基富集區(qū)形成的結(jié)構(gòu)域，并且是典型的Ⅱ型甲殼肽分子。因此，N末端的信號肽序列與C末端的WAP結(jié)構(gòu)域是Crustin家族分子的基本結(jié)構(gòu)特征。

本研究克隆得到了克氏原螯蝦一個新的crustin基因，根據(jù)目前其同源基因的發(fā)現(xiàn)順序，將其命名為Pc-crustin6基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Pc-Crustin 6分子具有甲殼肽家族分子的典型特征，包括N端的信號肽序列，C端的WAP結(jié)構(gòu)域，并且與Sm ith等[18]關(guān)于Crustin分子結(jié)構(gòu)特征的描述相一致?，F(xiàn)有結(jié)果顯示，crustin基因會在無脊椎動物的鰓組織中高表達(dá)，例如，孫保貞[19]通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)日本對蝦crustin-like基因在鰓組織中高表達(dá)；王慧[17]在擬穴青蟹中發(fā)現(xiàn)crustin2主要在鰓組織中表達(dá)。同樣，本研究中的Pc-crustin6基因在鰓組織中表達(dá)量最高，與以上結(jié)論一致，推測其可能與鰓組織的抗細(xì)菌作用相關(guān)。此外，SUN等[20]利用白斑病毒與弧菌分別刺激日本囊對蝦，在血細(xì)胞中檢測到crustin-like基因的上調(diào)表達(dá)，揭示了其在對蝦先天免疫中的潛在免疫作用。同時，李朝政利用LPS和副溶血性弧菌以及白斑病毒分別對凡納濱對蝦進行刺激之后，發(fā)現(xiàn)crustin基因在血細(xì)胞中的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，說明Lv-Crustin在凡納濱對蝦的先天免疫中發(fā)揮著重要作用，可能作為一種抗菌效應(yīng)分子在體內(nèi)發(fā)揮作用[21]。本研究利用鯰愛德華氏菌刺激小龍蝦之后，Pc-crustin6的表達(dá)量在2 h呈現(xiàn)急劇上升趨勢，表明鯰愛德華氏菌刺激后，crustin6表達(dá)發(fā)生改變，推測其在蝦抗鯰愛德華氏菌過程中發(fā)揮了作用。在小龍蝦鰓組織中，Pc-crustin6的表達(dá)量在2 h后出現(xiàn)持續(xù)降低趨勢，因為鰓組織是蝦類重要的呼吸器官，起著過濾水體的作用，而本試驗采用小龍蝦第二腹節(jié)注射細(xì)菌的方式模擬細(xì)菌感染時的情況，并非在水體中摻入細(xì)菌，因此鰓組織受到的細(xì)菌刺激就相對弱一些，激發(fā)起的免疫反應(yīng)隨之較弱。根據(jù)細(xì)菌刺激后表達(dá)模式的分析結(jié)果可以得出：細(xì)菌刺激早期，血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、腸組織中Pc-crustin6表達(dá)上調(diào)；細(xì)菌刺激后期，鰓組織除外，其他組織中Pc-crustin6又被高表達(dá)對細(xì)菌入侵作出應(yīng)答。

4 結(jié)論

在前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，通過對目的基因的克隆與功能分析，發(fā)現(xiàn)了一個小龍蝦新的crustin基因，命名為Pc-crustin6，利用實時熒光定量PCR檢測Pc-crustin6在不同組織中的mRNA表達(dá)量，以及細(xì)菌刺激后的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓和腸組織中的表達(dá)情況。為后續(xù)基因重組表達(dá)、抗體制備、功能研究提供一定的理論依據(jù)，對抗菌肽家族分子的進一步完善做出重要補充。近些年，針對小龍蝦等甲殼類動物的抗細(xì)菌先天免疫的相關(guān)研究結(jié)果較為豐富，先天免疫的基礎(chǔ)理論得到逐步完善；其中，甲殼肽作為重要的免疫效應(yīng)分子在小龍蝦中發(fā)揮著一系列抗菌作用，針對Pc-crustin6基因的深入研究對無脊椎動物抗細(xì)菌先天免疫基礎(chǔ)理論的進一步完善以及水生生物養(yǎng)殖實踐環(huán)節(jié)免疫策略的制定都有重要意義。