李杰，盧佳姝

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中居前列。CRC早期無明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)為中晚期。手術(shù)是目前臨床治療CRC的有效方式，但術(shù)后約50%的患者易發(fā)生CRC肝轉(zhuǎn)移，是造成CRC患者臨床治療失敗的主要原因[1]。隨著醫(yī)療水平的不斷提升，近年來CRC的診斷及治療有了明顯進(jìn)展，但其5年生存率仍在40%左右，仍有近25%的患者死于術(shù)后遠(yuǎn)處肝轉(zhuǎn)移[2-3]。故研究CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素，并采取有效的預(yù)防及治療措施仍是目前臨床關(guān)注的重點(diǎn)問題。

目前，CRC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。有研究認(rèn)為，一系列基因及表觀遺傳學(xué)的改變引起癌細(xì)胞中重要信號通路發(fā)生變化，部分基因表達(dá)受到影響而導(dǎo)致CRC的發(fā)生及發(fā)展[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼的單鏈小RNA，其轉(zhuǎn)錄后水平可調(diào)控多種基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用。既往研究證實(shí)[5-6]，微小RNA-106-3p(miRNA-106-3p)、微小RNA-654-5p(miRNA-654-5p)可在血清中長期穩(wěn)定存在，這種穩(wěn)定存在于血清循環(huán)中的miRNA在CRC肝轉(zhuǎn)移的早期診斷及療效評估等方面顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值，但關(guān)于其與CRC術(shù)后復(fù)發(fā)患者的關(guān)系研究尚少。血清miRNA作為新型標(biāo)志物，具有取材方便、檢測成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人群疾病的普查。本研究選取110例CRC肝轉(zhuǎn)移患者，分析其血清miRNA-106-3p、miRNA-654-5p水平與CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取泰州市人民醫(yī)院2014年12月至2017年12月收治的110例CRC肝轉(zhuǎn)移患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CT/MRI檢查證實(shí)為CRC異時(shí)性肝轉(zhuǎn)移；②首次參與此類研究且術(shù)前未接受放療、化療等治療；③符合姑息/根治手術(shù)指征且手術(shù)成功；④患者意識清晰且無溝通交流障礙；⑤知曉研究內(nèi)容且自愿簽署研究協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并胰腺疾病或其他系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤；②合并腸梗阻、腸瘺、腸套疊等其他腸道疾?。虎酆喜⑸窠?jīng)系統(tǒng)疾病及既往病史者；④治療依從性差或院內(nèi)資料不齊全者。本組患者年齡35～71歲，平均(46.1±10.1)歲；體質(zhì)量指數(shù)(20.13±5.49)kg/m2；結(jié)腸腫瘤70例，直腸腫瘤40例；腫瘤直徑≥4 cm者60例，腫瘤直徑<4 cm者50例；均行手術(shù)治療，其中行姑息手術(shù)40例，行根治性手術(shù)70例。本研究獲取得醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平 分別于術(shù)前、術(shù)后1 d抽取患者外周靜脈血，置于含抗凝素的離心管中，靜置15 min后，以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。使用miRNA提取試劑盒(購于德國Qiagen生物公司)，根據(jù)說明書操作要求提取樣本RNA，總RNA樣本于-80 ℃保存。采用MSPTouch納米滴分光光度計(jì)(購于北京世聯(lián)博研科技有限公司)測量RNA濃度。使用miRNA SYBR Green檢測系統(tǒng)(購于上海拓然生物科技有限公司)進(jìn)行RT-qPCR，將凍干的引物(購于德國Qiagen生物公司QuantiTect引物庫)溶于10Tris-EDTA緩沖液中，將RNU6作為miRNA-106-3p、miRNA-654-5p的管家基因，用如下PCR程序檢測上述提取的miRNA：1個(gè)周期(片段1)，95 ℃ 15 min；2個(gè)周期(片段2)，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s；30個(gè)周期。引物序列如下，miRNA-106-3p：正向5′-CAAATTAGACTTCTCTTGGGT-3′；反向5′-TGAAGGGGTATACGAAGGAAG-3′。miRNA-654-5p：正向5′-CCCTCCACAAAGCCCGCTTGA-3′；反向5′-CCTGCAAAGAGGCCTTTCATA-3′。RNU6：正向5′-CCTGTATCGAAGGGACCCTTA-3′；反向5′-ACTGCTGATGCTGCCATGCAA-3′。采用△△Ct法定量分析miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平，在上述試驗(yàn)條件下，獲得目標(biāo)基因RNU6的平均交叉點(diǎn)(Ct)值，RNU6包括試驗(yàn)條件、控制條件，分別對應(yīng)試驗(yàn)值、控制值，計(jì)算試驗(yàn)值及控制值之間的差異，即Ct值，可得2-△△Ct值，進(jìn)而得到miRNA相對表達(dá)量。

1.2.2 資料收集及隨訪 收集CRC肝轉(zhuǎn)移患者的臨床資料，如患者性別、年齡、吸煙飲酒史、原發(fā)腫瘤位置、脈管瘤栓、腫瘤分化程度、肝轉(zhuǎn)移病灶分布、TNM分期、手術(shù)方式、肝轉(zhuǎn)移瘤范圍、肝轉(zhuǎn)移瘤包膜是否完整、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶最大直徑等。隨訪3年，失訪5例。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對余下105例患者復(fù)發(fā)情況進(jìn)行判斷：經(jīng)MRI、超聲或其他影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)新發(fā)病灶，且血清中癌胚抗原(carcino embryonic antigen，CEA)<5 ng/ml，糖類抗原199(carbohydrate antigen，CA19-9)<37 U/L，表明無復(fù)發(fā)跡象，歸為未復(fù)發(fā)組，其余歸為復(fù)發(fā)組[7]。照此標(biāo)準(zhǔn)，105例患者中30例復(fù)發(fā)(復(fù)發(fā)組)，75例未復(fù)發(fā)(未復(fù)發(fā)組)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平比較

手術(shù)前，兩組miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。手術(shù)后，兩組miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)均上調(diào)，且復(fù)發(fā)組高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平比較

2.2 單因素分析可能影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、原發(fā)腫瘤位置及分化程度、脈管瘤栓、TNM分期、手術(shù)方式、肝轉(zhuǎn)移瘤包膜是否完整、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶最大直徑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的肝轉(zhuǎn)移病灶分布、肝轉(zhuǎn)移瘤范圍、術(shù)后miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 單因素分析可能影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

2.3 Logistic回歸分析影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

以CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)為因變量(復(fù)發(fā)=1，未復(fù)發(fā)=0)，以表1中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)為自變量[肝轉(zhuǎn)移病灶分布(雙葉=1，單葉=0)，肝轉(zhuǎn)移瘤范圍(全肝=1，半肝=0)，術(shù)后miRNA-106-3p表達(dá)量，術(shù)后miRNA-654-5p表達(dá)量]，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，肝轉(zhuǎn)移病灶雙葉分布、肝轉(zhuǎn)移瘤位于全肝、術(shù)后miRNA-106-3p、miRNA-654-5p高表達(dá)是影響CRC肝轉(zhuǎn)移術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 Logistic回歸分析影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

3 討論

肝臟是CRC轉(zhuǎn)移的常見部位，肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的最主要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道，約15%～20%的患者在確診CRC時(shí)即有肝轉(zhuǎn)移，約40%的CRC患者在術(shù)后易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，CRC肝轉(zhuǎn)移患者的遠(yuǎn)期預(yù)后生存情況不理想，若未經(jīng)治療，其中位生存時(shí)間僅為7個(gè)月[8-9]。目前國內(nèi)外較公認(rèn)的CRC肝轉(zhuǎn)移治療策略是手術(shù)治療。1980年首次通過臨床隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在合適時(shí)間進(jìn)行手術(shù)切除肝臟轉(zhuǎn)移病灶可明顯延長CRC肝轉(zhuǎn)移患者的生存時(shí)間[10]。但近年來的研究顯示，CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后5年生存率僅約為40%，術(shù)后復(fù)發(fā)概率約為25%～30%，術(shù)后復(fù)發(fā)是造成CRC肝轉(zhuǎn)移患者生存期縮短的主要原因[11]。本研究也得出類似結(jié)論，隨訪3年后，CRC肝轉(zhuǎn)移患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率為28.57%(30/105)，故評估CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素具有十分重要的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝轉(zhuǎn)移病灶雙葉分布、肝轉(zhuǎn)移瘤位于全肝、術(shù)后miRNA-106-3p、miRNA-654-5p高表達(dá)是影響CRC肝轉(zhuǎn)移術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。miRNA是一種小的非編碼RNA，可通過切割靶信使RNA、抑制靶基因翻譯等方式干擾靶基因表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡，對腫瘤惡性表型起促進(jìn)或抑制作用，與正常細(xì)胞比較，腫瘤細(xì)胞組織中miRNA存在異常表達(dá)，其在腫瘤形成及發(fā)展中起重要作用，可作為腫瘤病因?qū)W、組織分型及臨床分期的分子標(biāo)志物[12-13]。Ashrafizadeh等[14]通過比較胃癌患者與正常人的相關(guān)miRNA水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-124在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞，其表達(dá)下調(diào)可激活PI3K信號通路，促進(jìn)胃癌增殖。也有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27a及miRNA-18b可作為肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌的潛在預(yù)測生物分子標(biāo)志物，對優(yōu)化肝癌臨床治療方案、改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后均有積極意義[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CRC肝轉(zhuǎn)移患者中，與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組的miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)水平均上調(diào)，與Makondi等[16]研究結(jié)果一致，表明miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)上調(diào)可輔助判斷CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后是否復(fù)發(fā)，為臨床優(yōu)化CRC肝轉(zhuǎn)移的治療策略提供參考。推測源于miRNA可通過結(jié)合到特定信使RNA加速癌基因翻譯，從而參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的過程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化等生理過程[17]。Claudin(CLDN)是維持緊密連接結(jié)構(gòu)及功能的重要組成部分，具有完整的膜蛋白，在維持細(xì)胞極性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，miRNA-106-3p可通過調(diào)節(jié)CLDN癌基因而阻止溶質(zhì)、水等通過上皮細(xì)胞板間細(xì)胞旁空間，其表達(dá)上調(diào)可加速CRC細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而增加CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。既往研究證實(shí)，miRNA-654-5p與人信號傳導(dǎo)分子(SMAD)2、SMAD7有關(guān)，SMAD7是轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路的重要組成部分，其受到抑制可使轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅰ表達(dá)增加[18-19]。本研究中miRNA-654-5p上調(diào)可能對轉(zhuǎn)化生長因子-β途徑產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，繼而使相關(guān)癌基因表達(dá)升高，增加肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，根據(jù)術(shù)后miRNA-106-3p、miRNA-654-5p表達(dá)情況可輔助判斷CRC肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)，臨床價(jià)值較高。但因本研究樣本量有限，相關(guān)結(jié)論仍需多中心、大樣本臨床試驗(yàn)進(jìn)一步論證。