張倩，侯俊宸，王丹丹，張鶴達(dá)，唐金海，張建

乳腺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，是全球女性癌癥死亡的第二大原因，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2021年美國(guó)將有281 550例新發(fā)乳腺癌患者和43 600例乳腺癌死亡患者[1]。盡管近年來乳腺癌的治療有了顯著進(jìn)展，但其預(yù)后仍不盡如人意。在這種情況下，尋找新的早期診斷標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)對(duì)改善乳腺癌患者的預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)(excision repair cross complementary，ERCC)基因家族由9個(gè)基因組成(包括ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)，編碼參與復(fù)雜DNA修復(fù)機(jī)制的蛋白，負(fù)責(zé)清除DNA損傷并維持染色體的穩(wěn)定性[2]。ERCC基因被認(rèn)為是維持DNA修復(fù)能力的重要因素，是核苷酸切除修復(fù)通路的關(guān)鍵元件[3-6]。有研究表明ERCC基因家族成員在乳腺癌、骨肉瘤及肺癌中起重要作用[7-11]。然而，ERCC家族成員在乳腺癌患者中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過挖掘在線數(shù)據(jù)庫，分析ERCC家族成員在乳腺癌患者中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，為發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和開發(fā)更有效的乳腺癌治療藥物靶點(diǎn)提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集ERCC基因家族在TCGA中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù) 腫瘤基因組圖譜(TCGA)計(jì)劃是由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)和美國(guó)國(guó)家人類基因組研究所(National Human Genome Research Institute，NHGRI)于2006年聯(lián)合啟動(dòng)的項(xiàng)目。該計(jì)劃研究的癌癥類型共有39種，涉及29種癌癥器官，1萬多個(gè)腫瘤樣本，27萬多份文件，其中包括1 098例乳腺癌。本研究收集的臨床參數(shù)包括性別、年齡、腫瘤(T)階段、淋巴結(jié)(N)分期、轉(zhuǎn)移(M)分期。本研究使用TCGA推薦的基因組數(shù)據(jù)共享(Genomic Data Commons,GDC)傳輸工具下載了ERCC家族的高通量測(cè)序(high-throughput sequencing,HTSeq)及每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)(Fragments Per Kilobase of transcript Per Million mapped reads，F(xiàn)PKM)數(shù)據(jù)。

1.2 分析ERCC基因家族成員在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的mRNA表達(dá)差異 利用Perl 5.26軟件從HTSeq表達(dá)數(shù)據(jù)中獲取ERCC家族的mRNA表達(dá)水平。利用R3.6.0軟件中的limma軟件包分析ERCC家族在乳腺癌組織與乳腺癌癌旁組織中的表達(dá)差異。通過corrplot軟件包計(jì)算ERCC基因家族成員之間的相關(guān)性。使用pheatmap軟件包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.3 分析ERCC基因家族成員對(duì)乳腺癌患者生存預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值 ①采用單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸評(píng)估ERCC基因家族成員(ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)及各臨床參數(shù)與乳腺癌患者總生存期(OS)、無進(jìn)展生存期(PFS)、疾病特異性生存期(DSS)和無疾病生存期(DFS)的相關(guān)性。②采用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析ERCC基因家族成員(ERCC1、ERCC5、ERCC6L)對(duì)乳腺癌患者OS的預(yù)測(cè)價(jià)值。分析采用R3.6.0軟件的survival軟件包進(jìn)行，相關(guān)的森林圖用ggplot2包繪制。

1.4 分析ERCC基因家族成員與腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞(TIIC)的相關(guān)性 使用在線工具腫瘤免疫評(píng)估資源數(shù)據(jù)庫(TIMER)平臺(tái)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)計(jì)算TIMER中ERCC基因家族成員表達(dá)水平和乳腺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的系數(shù)，確定乳腺癌中ERCC基因家族成員的表達(dá)是否與免疫浸潤(rùn)水平相關(guān)。

1.5 基因集合富集分析(GSEA)利用GSEA 4.0.1軟件(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)鑒定ERCC基因家族成員(ERCC1、ERCC6L)差異表達(dá)的相關(guān)通路，以研究ERCC1和ERCC6L差異表達(dá)影響乳腺癌發(fā)生的潛在生物學(xué)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 ERCC基因成員在乳腺癌組織中的表達(dá)情況

共獲取到來自TCGA數(shù)據(jù)庫中的1 109個(gè)乳腺癌樣本和113個(gè)乳腺癌癌旁組織樣本的9個(gè)ERCC成員(ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERCC6、ERCC6L、ERCC6L2、ERCC8)的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。ERCC1的表達(dá)與ERCC2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，ERCC1的表達(dá)與ERCC4、ERCC6L2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，ERCC6的表達(dá)與ERCC6L2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖1、圖2)。相較于癌旁組織，乳腺癌組織中ERCC6L2、ERCC5、ERCC8表達(dá)下調(diào)，ERCC1、ERCC2、ERCC6L表達(dá)上調(diào)。ERCC3、ERCC4、ERCC6在乳腺癌與癌旁組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖1 ERCC基因家族成員表達(dá)之間的相關(guān)性

圖2 乳腺癌中ERCC基因家族成員表達(dá)譜熱圖

圖3 ERCC基因家族成員在乳腺癌與癌旁組織中的表達(dá)水平差異

2.2 ERCC基因家族成員在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值 單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，高表達(dá)的3個(gè)ERCC成員(ERCC1、ERCC5和ERCC6L)和2個(gè)臨床特征(年齡、分期)與乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)[ERCC1的風(fēng)險(xiǎn)比(HR):0.944(0.899～0.990)；ERCC5的HR:0.847(0.745～0.962)；ERCC6L的HR:1.116(1.007～1.238)，見表1]。

表1 單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析乳腺癌預(yù)后的影響因素

TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者的表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)顯示，ERCC1高表達(dá)與乳腺癌患者的OS和DSS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，ERCC5高表達(dá)僅與患者的OS呈負(fù)相關(guān)(P=0.002)，ERCC6L高表達(dá)與患者的OS、PFS、DSS、DFS均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，圖4～7)。多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，ERCC1和ERCC6L的高表達(dá)以及2個(gè)臨床特征(高齡和較晚的分期)是乳腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(圖8)。

圖4 ERCC基因家族成員表達(dá)差異對(duì)乳腺癌患者總生存期影響

圖5 ERCC基因家族成員表達(dá)差異對(duì)乳腺癌患者無進(jìn)展生存期影響

圖6 ERCC基因家族成員表達(dá)差異對(duì)乳腺癌患者特異性生存期影響

圖7 ERCC基因家族成員表達(dá)差異對(duì)乳腺癌患者無病生存期的影響

2.3 TIIC與ERCC基因家族成員之間的相關(guān)性 ERCC1的表達(dá)水平與B細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.109，P<0.001)、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.154，P<0.001)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.086，P<0.05)、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.083，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)，與CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=-0.154，P<0.001)呈正相關(guān)。ERCC6L的表達(dá)水平與腫瘤純度(r=0.141，P<0.001)、B細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=0.226，P<0.001)、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=0.162，P<0.001)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=0.195，P<0.001)、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平(r=0.169，P<0.001)呈正相關(guān)。余ERCC基因家族成員表達(dá)量與免疫細(xì)胞、腫瘤純度的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖9。

圖9 ERCC基因家族成員表達(dá)量與免疫細(xì)胞、腫瘤純度的相關(guān)性

2.4 ERCC基因家族成員在乳腺癌預(yù)后中的潛在作用機(jī)制 GSEA分析結(jié)果顯示，ERCC1高表達(dá)與“核糖體”“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”有關(guān)；ERCC6L高表達(dá)與“泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解”“剪接體”、“卵母細(xì)胞減數(shù)分裂”“嘧啶代謝”“卵母細(xì)胞減數(shù)分裂”“基底切除修復(fù)”“細(xì)胞周期”有關(guān)，見圖10。

圖10 基于GSEA與ERCC1、ERCC6L表達(dá)相關(guān)的KEGG富集分析

3 討論

生物信息學(xué)是一門對(duì)生物信息進(jìn)行收集、處理、存儲(chǔ)、傳播、分析和解釋的學(xué)科[12]。生物信息學(xué)分析已被用于探索多種癌癥的致癌機(jī)制[13-15]。ERCC基因家族成員的過表達(dá)已在多種腫瘤研究文獻(xiàn)中報(bào)道，且有證據(jù)表明ERCC基因家族成員在多種腫瘤的發(fā)生和預(yù)后中發(fā)揮重要作用[8,16-18]。本研究分析乳腺癌組織中表達(dá)的9種ERCC基因成員之間的相關(guān)性，并與正常乳腺組織相比，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ERCC成員(ERCC1、ERCC2、ERCC5、ERCC6L、ERCC6L2)在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，但僅ERCC1、ERCC2、ERCC6L高表達(dá)與乳腺癌患者的OS相關(guān)，僅ERCC6L高表達(dá)與乳腺癌患者的PFS相關(guān)。

DNA修復(fù)對(duì)維持遺傳的穩(wěn)定性至關(guān)重要，其主要經(jīng)過4種途徑進(jìn)行修復(fù)，包括堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)[19]。ERCC基因家族成員是影響核苷酸切除修復(fù)的重要因素[6]。ERCC1位于19q13.2，是核苷酸切除修復(fù)途徑的限速酶，能夠修復(fù)化學(xué)藥物引起的DNA損傷，在核酸損傷修復(fù)過程和細(xì)胞凋亡過程中起重要作用[20]。據(jù)報(bào)道，ERCC1可能是癌癥治療中克服化療耐藥性的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[21]，但ERCC1在乳腺癌中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響尚無研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中，ERCC1在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，ERCC1表達(dá)的增加與較差的OS及DSS顯著相關(guān)。ERCC1的表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)，單因素和多因素Cox回歸分析均證實(shí)了ERCC1在預(yù)測(cè)乳腺癌患者不良預(yù)后方面的價(jià)值，故推測(cè)高表達(dá)的ERCC1通過某種機(jī)制降低了腫瘤中免疫細(xì)胞的含量，增加了乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸，從而促進(jìn)了腫瘤的增殖，提示今后靶向ERCC1的免疫治療策略成為可能。

A：ERCC1；B：ERCC5；C：ERCC6L圖8 多變量Cox回歸分析乳腺癌預(yù)后的影響因素(*P<0.05，**P<0.01)

ERCC6L是從小鼠胚胎中成功克隆的新基因(GenBank接受號(hào)：AY172688)[22]。其在調(diào)節(jié)胚胎、大腦和其他組織的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[23-25]。最近有研究在多種惡性實(shí)體腫瘤中檢測(cè)到ERCC6L的異常表達(dá)，包括乳腺癌[26]、腎癌[27]及成神經(jīng)細(xì)胞瘤[28]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)抑制ERCC6L的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的增殖，表明ERCC6L可能是一種有效的抑制腫瘤進(jìn)展的生物標(biāo)志物[27]。本研究發(fā)現(xiàn)ERCC6L在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常乳腺組織，且在ERCC6L高表達(dá)的乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了多種癌癥相關(guān)通路，而ERCC6L在乳腺癌中高表達(dá)預(yù)示著較差的OS、PFS、DSS及DFS。Cox回歸分析證實(shí)高表達(dá)的ERCC6L可以導(dǎo)致乳腺癌較差的預(yù)后，并且與大多數(shù)類型的免疫細(xì)胞高浸潤(rùn)相關(guān)。故推測(cè)ERCC6L通過某種機(jī)制抑制免疫激活，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)來降低對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，提示今后部分患者可從靶向ERCC6L的免疫治療中獲益。

綜上所述，ERCC基因家族成員在乳腺癌組織中存在差異表達(dá)，并且與乳腺癌患者的臨床分期、疾病進(jìn)展及生存預(yù)后密切相關(guān)。但由于生物信息學(xué)分析的局限性，關(guān)于ERCC基因家族成員在乳腺癌中的功能以及相關(guān)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。