張羽,劉琰,李蘭蘭,李麗
稽留流產(missed abortion,MA)指胚胎或胎兒死亡后滯留于宮腔未能及時排出的一種流產類型[1]。其病因復雜多樣,包括染色體、內分泌、感染、免疫、解剖等因素的影響,且仍有50%病因不明。在不明原因自然流產中,染色體異??蛇_50%~85%[2]。本研究回顧性分析我院稽留流產病人絨毛染色體基因拷貝數檢測(genomic copy number variations,CNVs)及核型分析結果,進一步明確流產病因,從而更好地做出遺傳學咨詢、改善妊娠結局。
1.1 一般資料回顧性分析2018年8月至2019年8月西北婦女兒童醫(yī)院生殖婦科稽留流產病人235例。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。其納入標準:年齡范圍20~45歲,孕齡7~12周,此次妊娠經B超動態(tài)監(jiān)測為空孕囊或未見胎心搏動或胎心搏動消失者診斷為稽留流產,且妊娠期間無感染,無放射線、毒物接觸史,無生殖系統(tǒng)結構異常,無高血壓、糖尿病等內外科合并癥。所有病人簽署知情同意書。
1.2 研究方法稽留流產病人流產后收集絨毛組織10 mg,用生理鹽水沖洗殘留血液、剔除其他組織。采用Qiagen Blood & Tissue(德 國Qiagen GmbH)進行絨毛DNA提取,隨后進行文庫制備(EZGALO),最后采用高通量測序儀(NextSeq CN 500)進行測序。最后,將所測結果與人類基因組數據庫進行匹配比較。
1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用±s表示,采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 絨毛高通量測序染色體檢測結果235例稽留流產病人絨毛染色體檢測結果中,有70例(29.79%)結果正常,165例(70.21%)存在異常現象。其中染色體數目異常有118例(71.5%),染色體結構異常有47例(24.48%)(表1)。
表1 稽留流產病人235例絨毛染色體檢測結果∕%
2.1.1染色體數目異常結果在染色體數目異常中(n=118),以非整倍體為主,其中三體所占比例最高——46.7%(n=77),以16、22、21、15-三體最為高發(fā)。而所有的雙重三體均為21或22-三體合并其他三體(表2)。性染色體非整倍體包含1例三體(47,XN,+X)及7例單體(均為45,X)。嵌合體包含三體嵌合體、單體嵌合體、兩性嵌合體,其中三體嵌合體可見不等數量的3、17、18、20-三體。在235例病人中,除了1、19-三體未發(fā)現,其余編號染色體均可見三體存在。
表2 6例染色體雙重三體詳情
2.1.2染色體結構異常結果47例染色體結構異常的位點不同、拷貝數大小不等,導致其致病性不同。經查詢對比DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數據庫資源可得,未知致病性占55.32%(n=26)、多態(tài)性占25.53 %(n=12)與已知致病性19.15%(n=12),其中已知致病詳情見表3。
表3 已知致病性染色體結構異常病人9例詳情
所有未知致病性的異??截悢捣秶鸀?.12~3.64 Mb,多態(tài)性為0.28~1.06 Mb,已知致病性為0.24~99.42 Mb。
2.2 染色體異常與病人年齡、妊娠方式及流產次數的關系與三體組年齡(32.55±4.65)相比,雙重三 體 組 年 齡(38.67±3.14)明 顯 偏 高(t=4.41,P<0.05)。而染色體正常組年齡較異常組偏低(P<0.05),且年齡<35歲組染色體異常發(fā)生率明顯低于年齡≥35歲組(P<0.05);染色體的異常率與病人妊娠方式及既往流產次數無關(P>0.05)。見表4。
表4 稽留流產235例絨毛染色體異常相關因素分析
稽留流產發(fā)病率高,且病因不明、復雜多樣[3],檢測稽留流產病人染色體異常情況,有助于尋找流產原因,最終緩解病人及其家庭身心壓力[4]。
有數據報道,早期流產中胚胎染色體異常率可達50%~60%[5-8]。常規(guī)的G帶核型分析被用作檢測染色體非整倍性和不平衡的金標準,但此方法失敗率較高、易受母體細胞污染、只能檢測特定的染色體異常[9],可造成結果偏差[10]。而高通量測序技術作為第二代測序的代表,擁有高通量、高精準、低成本、易操作等優(yōu)勢[11],因而應用廣泛。并且范寶光等[12]指出,高通量基因測序技術能發(fā)現稽留流產絨毛染色體的微缺失或重復,為檢測染色體結構異常開辟了新的途徑,有望成為稽留流產絨毛染色體檢測的主要手段。
本研究正是采用高通量測序技術檢測235例稽留流產病人絨毛染色體異常情況及基因拷貝數,最終可得染色體異常率為70.21%,與Jurkovic D等[2]報道相近。
染色體異常包括數目與結構的異常,其中以染色體數目異常為主[13]。本研究結果中,染色體數目異常占71.5%(包括雙重三體及嵌合體),其中非整倍體可達染色體異常的54.55%。有文獻表明,大多數非整倍體的發(fā)生是因為卵母細胞第一次減數分裂錯誤所致[3]。而非整倍體改變中以染色體三體為主,并以16-三體出現頻次最高。與本研究一致:16-三體所占比例最高(33.77%),緊隨其后的有22-三體(19.48%)、21-三體(15.58%)、15-三體(5.19%)。但與大多數非整倍體發(fā)生原因不同的是,16-三體的發(fā)生可能與父系第一次減數分裂未分離關系更加密切[14]。雖然16-三體在早期流產中所占比例極高,但并不能完全說明16-三體是導致流產的主要因素。因其他染色體的異常可能會直接導致胚胎不著床而降低檢出率,或其異常染色體并不致死,可持續(xù)至孕中、晚期。此外,本研究所出現的77例三體中,除了1、19號染色體未發(fā)現三體外,其余編號染色體均存在染色體三體現象[15],且大部分文獻均未見1-三體報道[16]。
本研究所有嵌合體占異??倲档?6.9%,且嵌合類型不一。其中7例單體均為45,X(Turner綜合征),占非整倍體的7.8%。Turner綜合征在新生女嬰中發(fā)病率約達1∕5 000,臨床病例多見,常表現為身材矮小、性腺發(fā)育不良[17]。由于正常與異常細胞系比例不定,此結果不一定反映真實水平。
染色體結構異常包括重復、缺失、異位、倒位、插入等,本研究中數目異常與重復、缺失、重復與缺失并存。因高通量測序技術準確率、靈敏度均較高,可檢測100 kb以上片段大小。此235例樣本中發(fā)現了0.12~99.42 Mb大小不等的異常片段,擁有較高的染色體異常檢出率,增加了診斷的準確性。如上所述,基因異常的位點及大小不同,導致的致病性亦不同;但未知致病性及多態(tài)性的異常片段相對較小,易于得到基因補償而無臨床特殊癥狀表現。
年齡是影響妊娠的一大重要因素,年齡越大、流產率越高[18]。女性隨著年齡的增長,卵子質量會相應下降,且高齡會增加染色體不分離現象,從而導致非整倍體的發(fā)生。本研究進一步證明,染色體異常組病人年齡(32.08±4.52)明顯高于正常組(30.19±3.62),且 年 齡≥35歲 組 染 色 體 異 常 率(83.92%)較正常組(65.92%)偏高。而表2顯示,雙重三體病人的年齡(38.5±3.27)異常偏高,考慮高齡更易導致雙重三體的發(fā)生。而妊娠方式與染色體異常率并無相關關系,這與一項Meta分析結果相一致[19]。且本研究表明流產次數與染色體的異常率亦無明顯必然聯(lián)系。雖在6例雙重三體中,除了1例病人為自然妊娠,其余均為人類輔助生殖技術助孕,分析其原因可能為樣本數較小,且病人有不孕史、年齡偏大,因此采取了人類輔助生殖技術。
綜上所述,早期流產的主要原因仍以胚胎染色體異常為主。高齡可增加胚胎染色體的異常風險,但妊娠方式及既往流產次數對胚胎染色體并無明顯影響。高通量測序技術可準確、快速地檢出染色體異常率及異常情況。