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        稽留流產(chǎn)絨毛染色體通量測序技術(shù)檢測235例結(jié)果分析

        2022-01-04 08:10:18張羽劉琰李蘭蘭李麗
        安徽醫(yī)藥 2022年1期
        關(guān)鍵詞:嵌合體整倍體高通量

        張羽,劉琰,李蘭蘭,李麗

        稽留流產(chǎn)(missed abortion,MA)指胚胎或胎兒死亡后滯留于宮腔未能及時排出的一種流產(chǎn)類型[1]。其病因復(fù)雜多樣,包括染色體、內(nèi)分泌、感染、免疫、解剖等因素的影響,且仍有50%病因不明。在不明原因自然流產(chǎn)中,染色體異??蛇_(dá)50%~85%[2]。本研究回顧性分析我院稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體基因拷貝數(shù)檢測(genomic copy number variations,CNVs)及核型分析結(jié)果,進(jìn)一步明確流產(chǎn)病因,從而更好地做出遺傳學(xué)咨詢、改善妊娠結(jié)局。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料回顧性分析2018年8月至2019年8月西北婦女兒童醫(yī)院生殖婦科稽留流產(chǎn)病人235例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。其納入標(biāo)準(zhǔn):年齡范圍20~45歲,孕齡7~12周,此次妊娠經(jīng)B超動態(tài)監(jiān)測為空孕囊或未見胎心搏動或胎心搏動消失者診斷為稽留流產(chǎn),且妊娠期間無感染,無放射線、毒物接觸史,無生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常,無高血壓、糖尿病等內(nèi)外科合并癥。所有病人簽署知情同意書。

        1.2 研究方法稽留流產(chǎn)病人流產(chǎn)后收集絨毛組織10 mg,用生理鹽水沖洗殘留血液、剔除其他組織。采用Qiagen Blood & Tissue(德 國Qiagen GmbH)進(jìn)行絨毛DNA提取,隨后進(jìn)行文庫制備(EZGALO),最后采用高通量測序儀(NextSeq CN 500)進(jìn)行測序。最后,將所測結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配比較。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示,采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 絨毛高通量測序染色體檢測結(jié)果235例稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體檢測結(jié)果中,有70例(29.79%)結(jié)果正常,165例(70.21%)存在異?,F(xiàn)象。其中染色體數(shù)目異常有118例(71.5%),染色體結(jié)構(gòu)異常有47例(24.48%)(表1)。

        表1 稽留流產(chǎn)病人235例絨毛染色體檢測結(jié)果∕%

        2.1.1染色體數(shù)目異常結(jié)果在染色體數(shù)目異常中(n=118),以非整倍體為主,其中三體所占比例最高——46.7%(n=77),以16、22、21、15-三體最為高發(fā)。而所有的雙重三體均為21或22-三體合并其他三體(表2)。性染色體非整倍體包含1例三體(47,XN,+X)及7例單體(均為45,X)。嵌合體包含三體嵌合體、單體嵌合體、兩性嵌合體,其中三體嵌合體可見不等數(shù)量的3、17、18、20-三體。在235例病人中,除了1、19-三體未發(fā)現(xiàn),其余編號染色體均可見三體存在。

        表2 6例染色體雙重三體詳情

        2.1.2染色體結(jié)構(gòu)異常結(jié)果47例染色體結(jié)構(gòu)異常的位點不同、拷貝數(shù)大小不等,導(dǎo)致其致病性不同。經(jīng)查詢對比DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫資源可得,未知致病性占55.32%(n=26)、多態(tài)性占25.53 %(n=12)與已知致病性19.15%(n=12),其中已知致病詳情見表3。

        表3 已知致病性染色體結(jié)構(gòu)異常病人9例詳情

        所有未知致病性的異??截悢?shù)范圍為0.12~3.64 Mb,多態(tài)性為0.28~1.06 Mb,已知致病性為0.24~99.42 Mb。

        2.2 染色體異常與病人年齡、妊娠方式及流產(chǎn)次數(shù)的關(guān)系與三體組年齡(32.55±4.65)相比,雙重三 體 組 年 齡(38.67±3.14)明 顯 偏 高(t=4.41,P<0.05)。而染色體正常組年齡較異常組偏低(P<0.05),且年齡<35歲組染色體異常發(fā)生率明顯低于年齡≥35歲組(P<0.05);染色體的異常率與病人妊娠方式及既往流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)(P>0.05)。見表4。

        表4 稽留流產(chǎn)235例絨毛染色體異常相關(guān)因素分析

        3 討論

        稽留流產(chǎn)發(fā)病率高,且病因不明、復(fù)雜多樣[3],檢測稽留流產(chǎn)病人染色體異常情況,有助于尋找流產(chǎn)原因,最終緩解病人及其家庭身心壓力[4]。

        有數(shù)據(jù)報道,早期流產(chǎn)中胚胎染色體異常率可達(dá)50%~60%[5-8]。常規(guī)的G帶核型分析被用作檢測染色體非整倍性和不平衡的金標(biāo)準(zhǔn),但此方法失敗率較高、易受母體細(xì)胞污染、只能檢測特定的染色體異常[9],可造成結(jié)果偏差[10]。而高通量測序技術(shù)作為第二代測序的代表,擁有高通量、高精準(zhǔn)、低成本、易操作等優(yōu)勢[11],因而應(yīng)用廣泛。并且范寶光等[12]指出,高通量基因測序技術(shù)能發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)絨毛染色體的微缺失或重復(fù),為檢測染色體結(jié)構(gòu)異常開辟了新的途徑,有望成為稽留流產(chǎn)絨毛染色體檢測的主要手段。

        本研究正是采用高通量測序技術(shù)檢測235例稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體異常情況及基因拷貝數(shù),最終可得染色體異常率為70.21%,與Jurkovic D等[2]報道相近。

        染色體異常包括數(shù)目與結(jié)構(gòu)的異常,其中以染色體數(shù)目異常為主[13]。本研究結(jié)果中,染色體數(shù)目異常占71.5%(包括雙重三體及嵌合體),其中非整倍體可達(dá)染色體異常的54.55%。有文獻(xiàn)表明,大多數(shù)非整倍體的發(fā)生是因為卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂錯誤所致[3]。而非整倍體改變中以染色體三體為主,并以16-三體出現(xiàn)頻次最高。與本研究一致:16-三體所占比例最高(33.77%),緊隨其后的有22-三體(19.48%)、21-三體(15.58%)、15-三體(5.19%)。但與大多數(shù)非整倍體發(fā)生原因不同的是,16-三體的發(fā)生可能與父系第一次減數(shù)分裂未分離關(guān)系更加密切[14]。雖然16-三體在早期流產(chǎn)中所占比例極高,但并不能完全說明16-三體是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要因素。因其他染色體的異??赡軙苯訉?dǎo)致胚胎不著床而降低檢出率,或其異常染色體并不致死,可持續(xù)至孕中、晚期。此外,本研究所出現(xiàn)的77例三體中,除了1、19號染色體未發(fā)現(xiàn)三體外,其余編號染色體均存在染色體三體現(xiàn)象[15],且大部分文獻(xiàn)均未見1-三體報道[16]。

        本研究所有嵌合體占異??倲?shù)的16.9%,且嵌合類型不一。其中7例單體均為45,X(Turner綜合征),占非整倍體的7.8%。Turner綜合征在新生女嬰中發(fā)病率約達(dá)1∕5 000,臨床病例多見,常表現(xiàn)為身材矮小、性腺發(fā)育不良[17]。由于正常與異常細(xì)胞系比例不定,此結(jié)果不一定反映真實水平。

        染色體結(jié)構(gòu)異常包括重復(fù)、缺失、異位、倒位、插入等,本研究中數(shù)目異常與重復(fù)、缺失、重復(fù)與缺失并存。因高通量測序技術(shù)準(zhǔn)確率、靈敏度均較高,可檢測100 kb以上片段大小。此235例樣本中發(fā)現(xiàn)了0.12~99.42 Mb大小不等的異常片段,擁有較高的染色體異常檢出率,增加了診斷的準(zhǔn)確性。如上所述,基因異常的位點及大小不同,導(dǎo)致的致病性亦不同;但未知致病性及多態(tài)性的異常片段相對較小,易于得到基因補(bǔ)償而無臨床特殊癥狀表現(xiàn)。

        年齡是影響妊娠的一大重要因素,年齡越大、流產(chǎn)率越高[18]。女性隨著年齡的增長,卵子質(zhì)量會相應(yīng)下降,且高齡會增加染色體不分離現(xiàn)象,從而導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生。本研究進(jìn)一步證明,染色體異常組病人年齡(32.08±4.52)明顯高于正常組(30.19±3.62),且 年 齡≥35歲 組 染 色 體 異 常 率(83.92%)較正常組(65.92%)偏高。而表2顯示,雙重三體病人的年齡(38.5±3.27)異常偏高,考慮高齡更易導(dǎo)致雙重三體的發(fā)生。而妊娠方式與染色體異常率并無相關(guān)關(guān)系,這與一項Meta分析結(jié)果相一致[19]。且本研究表明流產(chǎn)次數(shù)與染色體的異常率亦無明顯必然聯(lián)系。雖在6例雙重三體中,除了1例病人為自然妊娠,其余均為人類輔助生殖技術(shù)助孕,分析其原因可能為樣本數(shù)較小,且病人有不孕史、年齡偏大,因此采取了人類輔助生殖技術(shù)。

        綜上所述,早期流產(chǎn)的主要原因仍以胚胎染色體異常為主。高齡可增加胚胎染色體的異常風(fēng)險,但妊娠方式及既往流產(chǎn)次數(shù)對胚胎染色體并無明顯影響。高通量測序技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地檢出染色體異常率及異常情況。

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