任靜，杜暉

復(fù)方枇杷噴托維林顆粒是由枇杷葉流浸膏、甘草流浸膏和枸櫞酸噴托維林等按一定比例制成，可用于上呼吸道感染、支氣管炎等引起的干咳或咳嗽少痰。枸櫞酸噴托維林是制劑中的化學(xué)藥組分，它是一種非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，實(shí)驗(yàn)中多采用HPLC法測(cè)定其含量［1］。甘草酸是甘草流浸膏中最主要的活性成分，包括其二銨鹽、苷類(lèi)具有抗炎［2-4］、抗病毒［5-7］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［8-9］及抑制肝損傷［10-14］等藥理作用；而甘草次酸是甘草酸在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，具有肝臟保護(hù)［15-16］和抗氧化作用［17］。有報(bào)道表明甘草酸及其代謝產(chǎn)物是中藥制劑發(fā)揮鎮(zhèn)咳功效的“使藥”成分之一［18］，所以兩者的含量與制劑的藥理活性緊密相關(guān)。該藥品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用紫外分光光度法測(cè)定制劑中枸櫞酸噴托維林的含量，方法需要經(jīng)甲基橙顯色氯仿提取，重現(xiàn)性較差［19-20］；有文獻(xiàn)對(duì)其中枸櫞酸噴托維林和甘草酸分別進(jìn)行含量測(cè)定［20-21］，但因采用兩種完全不同的色譜體系導(dǎo)致測(cè)定煩瑣，也無(wú)甘草酸代謝產(chǎn)物甘草次酸的含量控制項(xiàng)目。因此，建立一種能夠同時(shí)測(cè)定多種成分含量的方法尤為重要。本研究采用HPLC雙波長(zhǎng)法梯度洗脫快速測(cè)定復(fù)方枇杷噴托維林顆粒中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸三種成分的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供參考。本研究起止時(shí)間為2019年6月至2020年5月，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥熱電Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q Advantage超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）；MS105十萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒公司）。

復(fù)方枇杷噴托維林顆粒（江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)15121001、15121002、15012203）；甘草酸銨（批號(hào)110731～201720，含量97.7%）、甘草次酸（批號(hào)110723～201715，含量99.6%）和枸櫞酸噴托維林（批號(hào)100432～201803，含量99.8%）等對(duì)照品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇來(lái)自美國(guó)霍尼韋爾公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 樣品溶液的制備取10袋顆?；旌?，研細(xì)，稱(chēng)取適量（約10.000 g），置100 mL量瓶中，加50 mL水振搖使溶解，再用甲醇定容，濾過(guò)，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取甘草次酸對(duì)照品10.09 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度；精密稱(chēng)取枸櫞酸噴托維林對(duì)照品20.52 mg和甘草酸銨對(duì)照品10.02 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，精密加入甘草次酸對(duì)照品溶液2 mL，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2 mL、4 mL和10 mL，置20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即為混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 色譜條件熱電ScientificTMAcclaimTM120? C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，B為1%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0），二元梯度洗脫（0～5 min，60%A；5～20 min，A相線性上升至90%；20～25 min，90%A；25.1～30 min，60%A）；流速1.0 mL∕min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；DAD檢測(cè)（波長(zhǎng)設(shè)置為215 nm和250 nm）。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察精密量取“1.2.1.2”項(xiàng)下配制的枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的混合對(duì)照品溶液，分別注入色譜儀，以主成分峰面積Y（mAU·min）對(duì)濃度X（μg∕mL）進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999 9，見(jiàn)表1。

表1 三種組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.2 專(zhuān)屬性及樣品含量測(cè)定分別吸取混合對(duì)照品、批號(hào)為15012203的供試品和陰性樣品溶液10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖如圖1所示，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的保留時(shí)間分別為6.5 min、14.1 min和23.3 min，三種成分與雜質(zhì)之間分離良好。

圖1 HPLC色譜圖

按“1.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定三批復(fù)方枇杷噴托維林顆粒中三種組分的含量，如表2所示，枸櫞酸噴托維林和甘草酸的含量與處方量和文獻(xiàn)值基本一致［20-21］。其中甘草酸含量較之甘草流浸膏中甘草酸限值略低［22］，可能是顆粒長(zhǎng)時(shí)間存放或運(yùn)輸途中發(fā)生了變化。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3 精密度考察將批號(hào)為15012203的樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，發(fā)現(xiàn)枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸峰面積的RSD值分別為0.60%、0.59%和0.38%，證明儀器精密度能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

平行處理6份批號(hào)為15012203的樣品，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定樣品中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的含量，RSD值分別為0.68%、0.25%和0.79%，方法重復(fù)性良好。

為了考察不同人員和儀器對(duì)精密度的影響，重新配制混合對(duì)照品溶液并處理6份批號(hào)為15012203的樣品，測(cè)得樣品中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的平均含量分別為1.88 mg∕g，0.80 mg∕g和9.18 μg∕g，對(duì) 應(yīng) 的RSD分 別 為1.25%、0.52%和0.91%。結(jié)果顯示，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的F值分別為3.21、4.02和1.32，均小于置信度為95%時(shí)的F（5，5）值（5.05），說(shuō)明兩組精密度結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 穩(wěn)定性考察將上述溶液保存在4℃環(huán)境中，并在6 h、12 h、24 h和48 h后進(jìn)樣分析，三種組分含量的RSD值分別為1.51%、0.89%和2.02%，說(shuō)明樣品溶液在2 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5 回收率考察精密稱(chēng)取甘草次酸對(duì)照品4.52 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為甘草次酸溶液。精密稱(chēng)取枸櫞酸噴托維林對(duì)照品101.70 mg和甘草酸銨對(duì)照品41.45 mg，置同一10 mL量瓶中，用上述溶液溶解并稀釋至刻度。精密稱(chēng)取批號(hào)為15012203的樣品約5.00 g，置100 mL量瓶中，平行9份，分別精密加入上述混合對(duì)照品溶液0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL，每組平行3份，按“1.2.1.1”項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，計(jì)算平均回收率，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的平均回收率分別為102.27%，99.94%和98.02%，相應(yīng)的RSD為2.31%，2.33%和2.42%，結(jié)果如表3所示。

表3 三種組分的回收率

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：枸櫞酸噴托維林的最大吸收波長(zhǎng)為200 nm，而甘草酸和甘草次酸的最大吸收為250 nm。甲醇的紫外吸收波長(zhǎng)為205 nm，在此范圍內(nèi)測(cè)定基線不平穩(wěn)，干擾較明顯；但波長(zhǎng)大于215 nm，噴托維林的紫外吸收又明顯減弱。綜合考慮，我們?cè)O(shè)置為雙波長(zhǎng)215 nm和250 nm同時(shí)檢測(cè)。

提取溶劑的選擇：比較了相同的超聲時(shí)間下，甲醇、甲醇-水（50∶50）和水等三種溶劑的提取率和樣品出峰情況。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇的提取率最低，而顆粒在水中的溶解性最好；但溶劑與流動(dòng)相極性差別較大導(dǎo)致目標(biāo)物的色譜峰延展嚴(yán)重。故我們?cè)谒嵛镏屑尤胂嗤壤募状?，從而滿足我們的分析要求。

流動(dòng)相的選擇：本組嘗試采用乙腈-水（60∶40）和甲醇-水（70∶30）等度洗脫，發(fā)現(xiàn)甘草酸和甘草次酸的出峰時(shí)間較晚，且色譜峰有拖尾現(xiàn)象，故在水相中加入1%的三乙胺用以改善峰形。我們發(fā)現(xiàn)噴托維林和甘草酸的色譜峰在乙腈體系中較之甲醇寬，塔板數(shù)略低；另外藥典中對(duì)噴托維林的測(cè)定亦采用甲醇-水體系［23］。但是提高甲醇比例，枸櫞酸噴托維林又與相鄰雜質(zhì)峰無(wú)法基線分離。最后我們降低初始狀態(tài)下有機(jī)相比例，采用甲醇-1%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0）梯度洗脫，分離度和重現(xiàn)性較好。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中采用甲基橙分光光度法測(cè)定噴托維林的含量，且缺乏甘草酸和甘草次酸等成分的測(cè)定項(xiàng)目，所以標(biāo)準(zhǔn)的專(zhuān)屬性和全面性存在較大缺陷。本研究采用HPLC雙波長(zhǎng)法梯度洗脫同時(shí)對(duì)顆粒中三種組分進(jìn)行分離測(cè)定，簡(jiǎn)化了文獻(xiàn)中2個(gè)色譜體系才能完成的檢驗(yàn)任務(wù)，大大縮短了分析時(shí)間，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供了參考。