張冉 李蘭，2 夏華向，2 謝文瑞，2 何興祥，2

1廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（廣州510000）；2廣東省微生態(tài)治療工程技術研究中心（廣州510000）

胃息肉是胃黏膜上皮細胞增生并凸入胃內(nèi)形成的隆起性病變，近年來胃息肉發(fā)病率有上升趨勢［1］。胃息肉被認為有一定的癌變風險，但具體病因尚未明確。既往認為胃內(nèi)是無菌狀態(tài)，近年來的國內(nèi)外大量研究表明，胃有獨立的微生態(tài)體系［2］。正常人群胃內(nèi)有多種微生物定植，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）陰性人群胃內(nèi)細菌總量可達（1.38±0.72）×103CFU/g［3］，正常胃腸道菌群包括了厭氧菌、需氧菌、兼性厭氧菌，它們通過穩(wěn)定菌群結(jié)構(gòu)及多種調(diào)控系統(tǒng)去維護胃腸微環(huán)境的相對穩(wěn)定和平衡，抑制致病菌的生長［4］。胃微生態(tài)的改變可能是胃息肉發(fā)生的一個潛在致病因素。

既往對胃微生態(tài)的研究大多停留在分析生物多樣性、物種組成等方面，無法從微生物互作網(wǎng)絡的角度解析菌群-菌群之間的關系［5］。而且多數(shù)研究針對胃癌、胃潰瘍或者腸上皮化生等人群，對胃息肉患者菌群的研究較少，不同地區(qū)人群的胃微生態(tài)亦存在差異。此外，胃液具有獨特的菌群結(jié)構(gòu)，與唾液菌群、胃黏膜菌群不同。

本研究通過觀察胃息肉患者胃液微生物多樣性、物種組成、門、屬水平差異分析、菌群分子生態(tài)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，探討Hp 感染對胃息肉患者微生態(tài)的影響，以及菌群關系和功能基因之間的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)納入2019年4月1日至2020年9月30日于廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心接受胃鏡檢查并診斷為胃息肉患者，根據(jù)Hp 感染情況分為息肉Hp（+）組與息肉Hp（-）組。胃鏡下胃黏膜未見異常且Hp 陰性者為健康組。納入標準：（1）年齡20 ～80歲，性別不限；（2）1個月內(nèi)未使用抗生素且未進行過Hp根除治療的患者；（3）自愿簽署知情同意的受檢者。排除標準：（1）明確胃癌、胃潰瘍、既往有胃切除手術史的患者；（2）6 個月內(nèi)服用大劑量益生菌者。胃息肉診斷標準：胃鏡下診斷為胃息肉并經(jīng)病理活檢證實為非癌性息肉。

1.2 組織病理檢查及Hp感染情況判斷病理診斷由我院病理科完成。通過快速尿素酶試驗、硼酸美藍組織染色、C13 呼氣試驗判斷Hp 感染情況，三種檢查方式有一種為陽性則定義為Hp感染陽性。

1.3 胃液樣本收集及處理胃鏡消毒滅菌干燥后進入胃底部黏液湖，通過一次性醫(yī)用20 mL 注射器連接活檢孔道，抽取5 mL 胃液于15 mL 無菌離心管中，以6 000 RCF/min 離心10 min，分裝后凍存于-80 ℃冰箱。提取DNA 后，使用通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）及高保真DNA 聚合酶對選定的V3-V4 可變區(qū)進行PCR 擴增。使用KAPA Illumina Library Quantification Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，文庫質(zhì)檢合格后使用Illumina NovaSeq System 上機測序。

1.4 生物信息學分析基于R4.0.3、Rstudio 1.3.1093、Vsearch v2.15.1、Usearch v10.0.240 搭建測序平臺。測序得到的PE reads，對經(jīng)過Vsearch 拼接、Deblur 去噪、Usearch 聚類后形成擴增序列變異體（amplicon sequence variant，ASV）進行物種注釋，得到對應的物種信息和物種的豐度分布情況。通過R 包、STAMP2.1.3 進行α、β 多樣性，物種組成差異分析；Co-currence 網(wǎng)絡關系分析；BUGBASE 進行表型預測、PICRUSt 功能預測，分析健康組、息肉Hp（-）組、息肉Hp（+）組功能差異。

1.5 統(tǒng)計學方法運用SPSS 23.0 和R 包，STAMP進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用描述性分析研究對象資料。通過vegan 包進行α 多樣性分析；β 多樣性基于Jaccard 距離通過限制性主坐標軸分析；通過Welch′sttest 評估不同分組間物種門、屬水平的差異。BUGBASE 表型組間差異通過Mann-Whitney 檢驗?；贠UT與物種信息，通過igraph、WGCNA包，獲得基礎網(wǎng)絡參數(shù)，計算網(wǎng)絡相關性質(zhì)。PICRUSt功能預測，利用STAMP 進行KEGGL3 級別的組間Kruskal-WallisH檢驗，并通過Story FDR 校正，進行差異分析比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象資料成功收集81 例胃液標本，健康組28 例、息肉HP（-）組40 例和息肉HP（+）組13 例，年齡20 ～80 歲，見表1。

表1 研究對象資料Tab.1 Clinical characteristic of the study cohort

2.2 胃液α、β 多樣性分析如圖1A 所示，健康組、息肉Hp（+）組、息肉Hp（-）組的共有ASV 數(shù)為90 個，特異性ASV 數(shù)為分別為33、32、27 個。Richness、shannon 指數(shù)可分別反映微生物群落組成的豐富度和均勻度，而由圖1B、1C 可知三者α 多樣性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。β 多樣性可以描述不同樣品微生物群落構(gòu)成差異。通過CPCoA 顯示空間水平上三組間最大差異。β 多樣性差異有統(tǒng)計學意義（P=0.045，圖1D）。

圖1 胃液菌群生物多樣性分析Fig.1 Analysis of the bacterial diversity in gastric juice

2.3 胃液菌群的組成通過ASV 特征表與物種注釋，進行樹圖maptree分析，篩選豐度前100的ASV，用以表達多層物種關系（圖2A）；同時用柱狀圖表示各組門屬水平優(yōu)勢菌。胃液中有六種高豐度菌門匯聚，依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、梭桿菌門、Candidatus_Saccharibacteria（圖2B）。胃液中優(yōu)勢菌屬為鏈球菌、普雷沃氏菌、嗜鹽單胞菌、羅斯氏菌、韋榮球菌、奈瑟氏球菌、梭桿菌、放線菌、牙齦卟啉單胞、嗜血桿菌（圖2C）。

圖2 胃液菌群門、屬水平優(yōu)勢菌群構(gòu)成Fig.2 Composition of dominant microflora at phylum and genus level in gastric juice

2.4 STAMP 差異物種分析

2.4.1 門水平差異分析在門水平上，息肉Hp（-）組較健康組梭桿菌門豐度下降（P= 0.045）；息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組放線菌門豐度下降（P=0.003）。

2.4.2 屬水平差異分析在屬水平上，息肉Hp（-）組較健康組Catonella、Granulicatella 豐度降低，Novosphingobium、Caulobacter、Dietzia、Bradyrhizobium 豐度升高（P＜0.005）；息肉Hp（+）組較健康組Lachnoanaerobaculum 豐度升高，Achromobacter、Curvibacter、Glycocaulis、Sphingomonas、Nesterenkonia、Mesorhizobium、Halomonas豐度下降（P＜0.005）；息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組Lachnoanaerobaculum、Oribacterium 豐度升高（P＜0.005）。

2.5 Bugbase 表型分析對需氧菌、厭氧菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、生物膜形成、致病潛力、移動元件含量、氧的利用、氧化脅迫耐受九種表型進行分析。息肉Hp（-）組與息肉Hp（+）組在需氧菌上存在差異（P= 0.03），息肉Hp（-）組的物種豐度高于息肉Hp（+）組（40＞28），而在其他表型上未見顯著差異。利用OTUs 分析了需氧菌占主要貢獻的菌門，息肉Hp（-）組較息肉Hp（+）組Proteobacteria、Firmicutes 均升高。

2.6 胃液菌群Co-occurrence 網(wǎng)絡圖基于ASV和物種注釋，用R 包進行網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)基本參數(shù)分析，見表2。健康組的邊數(shù)為314，正向關系邊數(shù)為223，負向關系邊數(shù)為91，健康組與息肉Hp（-）組的網(wǎng)絡拓撲基本參數(shù)均大于息肉Hp（+）組。而健康組的負向邊數(shù)、節(jié)點數(shù)、緊密中心性、介數(shù)中心性大于息肉Hp（-）組。同時分別繪制三組Co-occurrence 網(wǎng)絡圖，反應主要網(wǎng)絡菌屬關系。通過屬水平的物種分類為節(jié)點配色，著色點大小反應物種在整個網(wǎng)絡關系的作用，不同顏色表示不同的物種；連線的顏色表示正負相關性，紅色表示正相關，藍色表示負相關；線的粗細表示相關性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關性越高；線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切，A 為健康組、B 為息肉Hp（+）組、C 為息肉Hp（-）組，見圖3。

圖3 三組菌群Co-occurrence 網(wǎng)絡關系Fig.3 Co-occurrence network of three groups of bacteria

表2 三組菌屬網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)基本參數(shù)Tab.2 Basic parameters of topological structure of three groups of bacteria

健康組的胃液菌群之間的菌屬關系更為復雜，Streptococcus、Prevotella、Rare_groups、Unassigned、Veillonella 存在正相關關系，同時Prevotella、Streptococcus、Unassigned 之間存在負相關關系；息肉Hp（+）組Unassigned、Rare_groups、Prevotella 存在正相關關系；息肉Hp（-）組中Streptococcus、Unassigned、Prevotella、Rare_groups 呈正相關與負相關關系，同時Streptococcus、Rare_groups、Rothia 呈正相關關系，見圖2。

2.7 PICRUSt 功能預測與差異分析息肉Hp（+）組較息肉Hp（-）組在糖基轉(zhuǎn)移酶、維生素B6 代謝、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉(zhuǎn)導、核糖體合成等代謝通路上調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

胃腸道內(nèi)棲息的微生物之間保持互生或拮抗關系，與人類的健康及疾病密切相關［6］。而胃微生態(tài)學的研究仍處于起步階段，雖然研究者對Hp感染如何影響胃微生態(tài)較為重視，但結(jié)論尚不明確。有研究表明Hp 感染可以顯著影響胃部菌群［7］，也有研究報道Hp 陰性、陽性患者之間的微生物組成無顯著差異［8］。既往的動物實驗發(fā)現(xiàn)急性、慢性感染Hp 均不會顯著改變鼠胃微生物的生態(tài)系統(tǒng)［9］，而HEIMESAAT 等［10］的研究表明感染了Hp 的小鼠盲腸中大腸桿菌豐度上升，說明Hp 陰性和陽性個體的細菌群落分布仍高度復雜，不同疾病狀態(tài)下的菌群關系有差異性。

本研究引入微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡體系，描述生物群落結(jié)構(gòu)，通過比較三者間的網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)可知，三組間生物多樣性不同。相較于息肉Hp（-）組及健康組，息肉Hp（+）組胃微生態(tài)網(wǎng)絡間的連線減少，分子生態(tài)網(wǎng)絡平均連接度與平均聚集系數(shù)下降，微生物群落結(jié)構(gòu)趨向多樣化且聯(lián)系程度減弱，從而導致物種間的信息、能量和物質(zhì)的傳遞效率下降。

微生物通過建立更多的相互作用關系以抵抗不良環(huán)境所帶來的壓力，健康人群的上消化道主要菌為需氧菌，息肉Hp（-）組需氧菌的物種豐度高于息肉Hp（+）組，說明需氧菌在維持胃微生態(tài)穩(wěn)態(tài)中起到重要作用［11］。正常人體的需氧菌如葡萄球菌、鏈球菌和乳酸桿菌，可以合成維生素、泛酸等營養(yǎng)素，參與糖類和蛋白質(zhì)代謝，促進鐵、鎂、鋅等礦物質(zhì)的吸收。同時保持相對穩(wěn)定比例狀態(tài)，有利于及時清除胃內(nèi)的致病菌及其產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，充分發(fā)揮生物拮抗和生物屏障功能。因此胃息肉者感染Hp 后需要注意需氧菌含量，及時調(diào)整胃微生態(tài)。

本次研究中，息肉Hp（+）組致病菌豐度上升，非致病菌豐度下降，與息肉Hp（-）組相比，息肉Hp（+）組Oribacterium、Lachnoanaerobaculum 豐度上升，其與早期大腸癌、反流性食管炎等消化系統(tǒng)疾病密切相關［12-14］。與健康組相比，息肉Hp（+）組非致病菌豐度下降，如Achromobacter、Glycocaulis、Nesterenkoni 等豐度下降，其常在健康者體內(nèi)作為常駐菌被檢出。通過PICRUST 功能預測可知息肉Hp（+）組與息肉Hp（-）組菌群代謝通路差異明顯。主要表現(xiàn)在息肉Hp（+）組與幽門螺桿菌相關的致病代謝與炎癥通路明顯上調(diào)，如非同源端接上調(diào)，該機制受感染調(diào)節(jié)，幽門螺桿菌感染引起過多的DNA 損傷，為了維持基因組完整性，胃上皮細胞通過該通路進行完整的DNA 損傷修復（DDR）［15］；同時，維生素B6 生物合成酶被認為是細菌中的新型毒力因子，維生素B6 代謝上調(diào)加速幽門螺桿菌的糖基化鞭毛合成和鞭毛運動［16］。綜上可知，幽門螺桿菌感染使胃息肉患者致病菌豐度上升，常駐菌豐度下降，同時影響胃息肉患者胃部菌群的代謝，加劇了炎癥反應，因此胃息肉患者需進行Hp 檢測，若為陽性，需要積極治療。

與息肉Hp（-）組相比，健康組菌群之間存在更多的正向邊與負向邊關系，菌群之間的相關性節(jié)點更多，說明菌群之間的競爭與協(xié)作的關系更加復雜，微生態(tài)穩(wěn)定性更高。而胃息肉者的菌群之間的相關性節(jié)點變少，菌群作用關系減弱。在感染幽門螺旋桿菌后，菌群群落之間的聯(lián)系進一步下降，競爭關系減少，復雜程度降低。組間進行差異結(jié)果表明：息肉Hp（-）組Catonella、Granulicatella 屬豐度下降，他們通常在人體口腔、胃腸道黏膜上共生［17］；而Novosphingobium、Caulobacter、Dietzia、Bradyrhizobium 等與疾病相關的優(yōu)勢菌屬升高，如Novosphingobium 與胃腸道疾病有關［18］，Dietzia 牙髓感染密切相關［4］。本研究表明胃息肉患者微生態(tài)紊亂后，致病菌豐度升高，常駐菌豐度下降。

本次研究發(fā)現(xiàn)，Lachnoanaerobaculum 在健康組、息肉Hp（-）組、息肉Hp（+）組相對豐度依次升高。而檢測到的優(yōu)勢菌門、菌屬與既往的研究中的優(yōu)勢菌并不相同，如嗜鹽單胞菌屬既往的研究少有報道。從胃液菌群門水平的研究表明，胃息肉患者的菌群豐度發(fā)生改變，與既往的門水平無變化的結(jié)果不同［19］，原因可能與本次研究主要針對南方人群有關，與先前針對的北方人群不同［20］，提示在研究胃微生態(tài)時主要注意地域差異。

本研究通過生物信息學分析，表明胃息肉患者胃液微生態(tài)發(fā)生了紊亂，生物多樣性受到影響，菌-菌的作用關系趨向簡單，抵御致病菌群的能力下降，同時幽門螺桿菌作為一個致病因素會進一步加重胃息肉患者的微生態(tài)紊亂。

本研究有以下局限性：本研究樣本量有限，分配給亞組的樣本數(shù)量相對較少，研究結(jié)論有待更大樣本量的研究進一步驗證；此外，本研究只分析了胃細菌，真菌或病毒及其變化的影響需要進一步研究。