楊 永，范 蓉，張學(xué)軍，李寐華，凌悅銘，張 紅，楊文莉，姜 雪，張永兵，伊鴻平

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091；2.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】甜味(糖含量)是衡量甜瓜品質(zhì)的核心指標(biāo)。由于間接反應(yīng)可溶性糖總量的可溶性固形物含量測量簡便易行，在育種材料創(chuàng)制過程中，心部果肉和邊部果肉可溶性固形物含量是重要品質(zhì)指標(biāo)。而甜瓜果肉中可溶性糖可進(jìn)一步分為葡萄糖、果糖和蔗糖三種組分，且以蔗糖為主，蔗糖含量和總糖含量呈極顯著正相關(guān)[1]，蔗糖含量的高低在很大程度上決定了果肉的甜味程度。厚皮甜瓜心部果肉可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖含量占比最高。準(zhǔn)確定位控制厚皮甜瓜果肉蔗糖含量的主效QTL，并挖掘相關(guān)候選基因，對于厚皮甜瓜果肉品質(zhì)的分子遺傳改良，創(chuàng)制高糖育種材料具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甜瓜果實(shí)中3種可溶性糖含量隨果實(shí)發(fā)育而變化，其中果糖、葡萄糖呈先增加后變平緩或降低的變化趨勢，蔗糖呈持續(xù)增加的變化趨勢[1-4]。在幼果期，果糖、葡萄糖和蔗糖經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，主要參與糖酵解、磷酸戊糖途徑和細(xì)胞壁物質(zhì)合成等過程，為果實(shí)發(fā)育提供碳骨架和能量，蔗糖積累量很少或不積累；在果實(shí)發(fā)育后期，CmSPS1(蔗糖磷酸合成酶基因)和CmSPP1(蔗糖磷酸化酶基因)表達(dá)上調(diào)，引導(dǎo)糖代謝初始階段的產(chǎn)物用于蔗糖合成和儲存[3]，使得蔗糖含量在果實(shí)庫中迅速增加。QTL作圖是基因精細(xì)定位和克隆的基礎(chǔ)，是數(shù)量性狀遺傳研究的常用方法[5]。張寧等[6]認(rèn)為蔗糖含量受一對加性主基因+加性-顯性多基因模型控制(D-2)，主基因在F2群體中具有較高的的遺傳率，達(dá)83.76%；而呂律[7]認(rèn)為蔗糖含量受2對加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因(MX2-ADI-AD 模型)控制。張寧等[8]基于F2群體在第3和第4號連鎖群上，檢測到與總糖和果糖相關(guān)的QTL各一個，解釋遺傳變異率分別為14.89%和13.02%，未檢測到與蔗糖相關(guān)的QTL。Harel-Beja等[9]基于99個家系組成的重組自交系群體，在LG2、LG3、LG5、LG8四個連鎖群上共定位到7個與蔗糖含量積累相關(guān)的QTL位點(diǎn)。Argyris等[10]發(fā)現(xiàn)一個控制蔗糖和可溶性固形物含量的位點(diǎn)SUCQSC5.1，可減少蔗糖積累量達(dá)到34%，并推測該位點(diǎn)上的MELO3C014519基因?qū)μ鸸瞎庵姓崽欠e累起到了重要調(diào)控作用。鄧冠聰[11]基于薄皮和厚皮甜瓜材料為雙親構(gòu)建的重組自交系群體在春秋兩季各定位到3個QTL，分別位于Chr_7、Chr_10 和 Chr_11 和 Chr_4、Chr_5 和 Chr_10 上。Elad Oren 等[12]綜合前人研究結(jié)果認(rèn)為蔗糖代謝和積累的遺傳是復(fù)雜的，可能是受多個微效QTL控制的，而不是主基因的變異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對調(diào)控甜瓜果實(shí)可溶性糖積累的關(guān)鍵基因還知之甚少。甜瓜可溶性糖含量是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境因素等影響較大。截至目前，雖在多個染色體上發(fā)現(xiàn)控制甜瓜果肉蔗糖含量的QTL，但挖掘到功能基因的研究鮮有報(bào)道，有關(guān)甜瓜可溶性糖含量QTL定位和基因挖掘的研究進(jìn)展緩慢，限制了利用分子手段對該性狀進(jìn)行遺傳改良。厚皮甜瓜果肉較厚，一般心部果肉含糖量與邊部果肉具有明顯差異，可能存在不同的調(diào)控機(jī)制，需逐步深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高糖材料VZX(V醉仙)和低糖材料HP(高代自交系)為雙親，構(gòu)建F2群體，利用高效液相色譜儀測定成熟果實(shí)赤道位置心部果肉蔗糖含量，挑選出蔗糖含量極端材料混池并聯(lián)合雙親進(jìn)行重測序，分析與厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量相關(guān)的主效QTL，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，挖掘關(guān)鍵候選基因，為利用分子手段培育高蔗糖含量的厚皮甜瓜新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供。以高糖材料VZX(V醉仙)和低糖材料HP(高代自交系)為雙親雜交獲得F1，再自交1代獲得F2種子。將雙親及F2群體于2020年3月2日育苗，3月20日移栽，種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心吐魯番農(nóng)科所基地。雙親各種植20株，F(xiàn)2群體共種植200株，吊蔓生長，單蔓整枝，每株留1果，坐果節(jié)位在8～10節(jié)，種植模式及水肥管理均一致。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集及蔗糖含量

于果實(shí)成熟期，利用打孔器在每個果實(shí)赤道位置選取3個點(diǎn)采集圓柱狀果肉，去除黏連的胎座，切取近種腔端1/3的果肉作為心部果肉，將3個取樣點(diǎn)樣品混合存放于凍存管中，置于液氮速凍，待萃取蔗糖。

蔗糖萃取及測定均參照楊永等[1]和朱勇等[13]提供的方法。

1.2.2 極端混池(BSA)及QTL定位

在幼果期，采集幼嫩葉片于凍存管中，液氮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-80℃超低溫冰箱保存，待CTAB法提取DNA。利用高效液相色譜儀測定F2群體心部果肉蔗糖含量后，將20株蔗糖含量極端高和20株蔗糖含量極端低的材料DNA分別提取，并等量混合，構(gòu)建高蔗糖池和低蔗糖池。將2個混池和雙親DNA通過片段化試劑盒打斷成長度為400 bp的片段進(jìn)行文庫制備，以Novaseq 6000測序平臺 PE150測序模式進(jìn)行全基因組重測序。對原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后獲得的clean data與伽師瓜參考基因組進(jìn)行比對(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/ GCA_009760825.1)，并根據(jù)比對結(jié)果進(jìn)行SNP的檢測和注釋。計(jì)算混池之間基因型頻率的顯著差異，用SNP-index統(tǒng)計(jì)，標(biāo)記SNP與性狀關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)，SNP-index越接近于1，進(jìn)而對目標(biāo)性狀區(qū)域定位；基于歐式距離(Euclidean Distance，ED)算法，利用混池間基因型存在差異的SNP位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)各個堿基在不同混池中的深度，并計(jì)算每個位點(diǎn)ED值，與目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的基因所在的區(qū)域ED值會顯著高于閾值。

基于SNP-index統(tǒng)計(jì)和歐式距離(Euclidean Distance，ED)算法計(jì)算混池間存在顯著基因型頻率差異的SNP位點(diǎn)，并與心部果肉蔗糖含量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，ΔSNP-index 和ED值高于閾值的位點(diǎn)區(qū)域，被認(rèn)為與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)。研究將原始ED值的 2 次方作為關(guān)聯(lián)值，然后采用局部線性回歸 LOESS方法對ED值進(jìn)行擬合，以消除背景噪音的影響。

杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司提供技術(shù)支持。

1.2.3 候選基因

基于參考基因組信息，挑選出BSA定位區(qū)間中的基因，利用GO富集分析和KEGG通路分析，挖掘潛在的與蔗糖含量相關(guān)的候選基因，并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(測定了VZX和HP授粉后20 d、30 d和40 d心部果肉轉(zhuǎn)錄組；由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供技術(shù)支持)進(jìn)行驗(yàn)證，利用IGV2.9.4軟件對候選基因在雙親間的差異位點(diǎn)進(jìn)行分析，為分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親及F2群體心部果肉蔗糖含量表型分析

研究表明，高糖親本VZX(V醉仙)心部果肉蔗糖含量為72.54 mg/g，而低糖親本HP(高代自交系)心部果肉蔗糖含量為46.66 mg/g，兩者之間具有極顯著差異，平均相差25.88 mg/g。F2群體心部果肉蔗糖含量最低為2.2 mg/g，含量最高可達(dá)79.85 mg/g，平均為43.64 mg/g，差異較大，呈連續(xù)分布的特點(diǎn)。F2群體心部果肉蔗糖含量頻次分布近似呈正太分布，符合數(shù)量性狀的基本特征，可用于蔗糖含量性狀BSA定位分析。圖1,圖2

圖1 雙親心部果肉蔗糖含量差異Fig.1 Difference of sucrose content in center flesh of parents

圖2 F2群體心部果肉蔗糖含量頻次分布Fig.2 Frequency distribution of sucrose content among the F2 population

2.2 極端群體混池的構(gòu)建及測序

研究表明，從F2群體中選擇心部果肉蔗糖含量極端高和極端低單株各20個構(gòu)建高蔗糖池和低蔗糖池，聯(lián)同雙親進(jìn)行全基因組重測序，獲得有效測序數(shù)據(jù)共32.62 G，雙親及兩個混池有效數(shù)據(jù)平均為8.16G，Q20在95%以上，Q30在89%以上，GC含量在36.16%～44.01%，比對到參考基因組上的總reads數(shù)目比例在98.72%～99.02%，平均覆蓋深度為17.76。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，與選擇的參考基因組比對效率高，能夠滿足后續(xù)變異SNP位點(diǎn)的檢測和心部果肉蔗糖含量的QTL定位。表1

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量Table 1 Quality statistics of sequence data

2.3 厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位

研究表明，雙親及兩個混池共檢測到5 627 028個SNP變異位點(diǎn)，子代混池SNP位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換類型SNP位點(diǎn)數(shù)、顛換類型的SNP位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換顛換比均明顯高于雙親；子代混池雜合SNP位點(diǎn)數(shù)明顯高于純合位點(diǎn)數(shù)，高蔗糖池和低蔗糖池雜合比分別為67.74%和69.03%，雙親雜合SNP位點(diǎn)數(shù)明顯低于純合位點(diǎn)數(shù)，高蔗糖親本VZX和低蔗糖親本HP雜合比分別為26.58%和23.09%。表2

表2 SNP變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of SNP polymorphism site

基于ΔSNP-index和歐式距離均定位到8號染色體上18 980 000 ～22 270 000 bp共計(jì)3.29 Mb的區(qū)間。圖3、圖4

圖3 基于SNP-index對厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位Fig. 3 QTL mapping of sucrose content in center flesh of muskmelon based on SNP-index

圖4 基于歐式距離對厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL定位Fig.4 QTL mapping of sucrose content in center flesh of muskmelon based on Euclidean distance

2.4 厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量相關(guān)候選基因

研究表明，8號染色體上3.29 Mb區(qū)間共注釋到108個基因，在GO、KEGG、SwissProt、NOG等數(shù)據(jù)庫分別注釋到88個、40個、72個和101個。71個基因參與生物學(xué)合成過程，133個基因參與細(xì)胞組分，17個基因參與分子功能；KEGG通路分析表明，參與有機(jī)體系統(tǒng)的基因有3個，參與代謝的基因有32個，參與遺傳信息傳遞的基因有14個，參與環(huán)境信息傳遞的基因有6個，參與細(xì)胞過程的基因有1個。值得特別關(guān)注的是GO富集分析參與分子功能的部分，有4個基因(EVM0001419、EVM0004758、EVM0005074和EVM0013242)具有β-半乳糖苷酶活性，但進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)4個基因在VZX和HP兩份親本材料果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量均比較低，且差異較小，初定位區(qū)間中注釋到的4個β-半乳糖苷酶基因很可能不是造成雙親蔗糖積累差異的關(guān)鍵基因；KEGG通路分析中顯示參與碳水化合物代謝的基因有7個，除4個β-半乳糖苷酶基因外，還有三個基因分別為EVM0000647、EVM0008701和EVM0019814，其中EVM0008701和EVM0019814表達(dá)量相對較低，且雙親間差異不明顯，而EVM0000647基因表達(dá)量較高，且雙親間具有明顯差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，EVM0000647基因參與糖酵解和糖異生的代謝通路。在IGV軟件上，顯示為彩色的位置均表示與參考基因組堿基不同，該基因有8個內(nèi)含子和9個外顯子組成，僅在第8個外顯子上存在一個同義突變(GTT/GTC)，均編碼纈氨酸，其它外顯子均無有差異的SNP位點(diǎn)，該基因并非通過蛋白質(zhì)序列差異影響蔗糖的積累，很可能通過基因表達(dá)量的差異，造成不同材料果實(shí)蔗糖積累的不同。雙親間在該基因啟動子區(qū)域存在大量的變異位點(diǎn)。表3，表4，圖5～7

表3 候選區(qū)間不同數(shù)據(jù)庫注釋基因數(shù)量Table 3 Number of annotated genes in different databases in the candidate interval

圖6 KEGG通路分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of candidate genes

注：A：基因EVM值0000647基本結(jié)構(gòu)及雙親差異位點(diǎn)；B：雙親在基因EVM值0000647第8個外顯子上的SNP差異位點(diǎn)；C：基因EVM值0000647在雙親間的差異表達(dá)

表4 與糖代謝相關(guān)的候選基因Table 4 Candidate genes involved in sugar metabolism

3 討 論

新疆甜瓜地方品種資源果實(shí)含糖量，是最為迫切需要改良的性狀之一[14, 15]。121份新疆農(nóng)家品種資源可溶性固形物含量最低為5%，最高達(dá)18%，具有廣泛的遺傳變異[15]?？扇苄怨绦挝锖渴枪麑?shí)可溶性糖含量的間接反應(yīng)，甜瓜果實(shí)中可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖含量一般為最主要的糖組分[3, 4, 9]。研究選擇高糖材料VZX和低糖材料HP作為雙親構(gòu)建了F2群體，并利用液相色譜儀測定了雙親及F2群體心部果肉蔗糖含量，顯示雙親間具有極顯著差異，F(xiàn)2群體內(nèi)蔗糖含量最低為2.20 mg/g，最高可達(dá)79.85 mg/g，差異明顯，其蔗糖含量分布基本呈正太分布，符合典型的數(shù)量性狀遺傳特征。張寧等[8]構(gòu)建的F2群體中蔗糖含量最低為1.514 mg/g，最高為67.25 mg/g，與研究中F2群體表型測定結(jié)果類似。

極端混池測序(Bulked segregant analysis，簡稱BSA)是一種快速、簡便有效、低成本的數(shù)量性狀位點(diǎn)定位方法[16]。研究利用F2群體，構(gòu)建了極端混池結(jié)合全基因組重測序?qū)衿ぬ鸸闲牟抗庹崽呛窟M(jìn)行了定位，在8號染色體上定位到一個大小為3.29 Mb的QTL位點(diǎn)。Harel-Beja等[9]利用PI414723和Dulce為雙親衍生的重組自交系群體，構(gòu)建了一個包含668個DNA標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，2006年在LG2、LG3、LG5和LG8連鎖群上共定位到與蔗糖含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)6個，而2007年僅在LG3上定位到1個QTL位點(diǎn)，其中2006年8號連鎖群上定位到的QTL可解釋18.3%的表型遺傳變異。張寧等[8]利用F2群體構(gòu)建了SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，在3號和4號連鎖群上分別定位到與總糖和果糖含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)各1個，未定位到與蔗糖相關(guān)的QTL。Argyris等[10]基于近等基因系群體，在2、3、4、5、7、8和11號染色體上共定位到11個與蔗糖含量相關(guān)的QTL；基于F2、BC1、BC2和IL等群體，在4、5和10號染色體上共定位到6個與蔗糖含量相關(guān)的QTL；在5號染色體上存在一個穩(wěn)定的QTL即sucqsc5.1。綜上可見，甜瓜果實(shí)蔗糖含量性狀為多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[10]，在一定程度上阻礙了包括蔗糖在內(nèi)的甜瓜果肉可溶性糖含量性狀的QTL定位及功能基因挖掘。蔗糖含量表型的準(zhǔn)確鑒定是影響其QTL定位的又一主要因素。蔗糖在果實(shí)發(fā)育前期基本無積累，在果實(shí)發(fā)育后期蔗糖積累迅速增加[1]，果實(shí)完全成熟是影響蔗糖含量表型準(zhǔn)確鑒定的關(guān)鍵；受栽培環(huán)境及管理措施的影響，植株的生長狀況也會影響蔗糖含量表型的鑒定；蔗糖含量的準(zhǔn)確測定一般需要利用高效液相色譜的方法，除遺傳群體的種植管理外，還涉及到樣品采集、可溶性糖萃取、測定等環(huán)節(jié)，限制了用于QTL定位的群體規(guī)模。

研究在3.29 Mb的定位區(qū)間內(nèi)，利用伽師瓜參考基因組(HTTPS://WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/ASSEMBLY/GCA_009760825.1)共注釋到108個基因。通過GO富集分析和KEGG通路分析，進(jìn)一步聚焦到碳水化合物代謝通路上的7個基因，其中4個推測為β-半乳糖苷酶基因，但雙親不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，4個β-半乳糖苷酶基因在果實(shí)發(fā)育過程中基因表達(dá)量都非常低。Ren Yi 等[17]發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶基因在西瓜果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量也非常低，而高表達(dá)的α-半乳糖甘酶ClAGA2基因被認(rèn)為是西瓜果實(shí)蔗糖積累過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，同源比對甜瓜上的α-半乳糖甘酶基因也位于8號染色體，但并未在研究定位區(qū)間內(nèi)，可能甜瓜和西瓜在蔗糖積累的分子調(diào)控上是存在一定差異的。蔗糖積累在甜瓜果實(shí)幼果期和成熟期有著明顯的差異，幼果期可溶性糖主要被用于果實(shí)生長發(fā)育和提供能量，成熟期果實(shí)停止生長，主要以蔗糖的形式貯存起來[3]。在之前的研究中也發(fā)現(xiàn)[1]，蔗糖積累的起始時(shí)間可能是造成不同材料間蔗糖含量差異的重要原因，MELO3C014519 基因被認(rèn)為可能是通過其高表達(dá)延長了果實(shí)生長過程，而阻礙了蔗糖的積累，造成了雙親材料蔗糖含量的差異[10]。研究中參與碳水化合物代謝的另外3個基因(EVM0000647、EVM0008701和EVM0019814)，EVM0008701和EVM0019814在VZX和HP兩份材料果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量相對較低，且差異不明顯，而EVM0000647基因表達(dá)量較高，參與糖酵解和糖異生的生化過程，且雙親間具有明顯差異，該基因在低糖親本HP的表達(dá)量在果實(shí)3個不同發(fā)育時(shí)期均明顯高于高糖親本VZX。VZX和HP在該基因編碼區(qū)僅存在一個同義突變，但在啟動子區(qū)域存在大量的差異位點(diǎn)，該基因可能也通過表達(dá)量的差異負(fù)向調(diào)控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的積累，但還有待于進(jìn)一步通過基因編輯等方法驗(yàn)證該基因的功能。

4 結(jié) 論

利用VZX和HP為雙親及其衍生的F2群體，在8號染色體上定位到1個影響厚皮甜瓜心部果肉蔗糖含量的QTL，大小為3.29 Mb；在參考基因組上共注釋到108個基因，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在初定位區(qū)間內(nèi)獲得一個參與糖酵解和糖異生生化過程、高表達(dá)且表達(dá)量在雙親間具有明顯差異的候選基因EVM0000647；該基因可能通過表達(dá)量的差異負(fù)向調(diào)控厚皮甜瓜心部果肉蔗糖的積累。