石樂天，陳勇臻，郭騰達(dá)，劉金鑠，張光輝，陳鵬舉

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2.焦作工學(xué)院，河南焦作，454000；3.河南省現(xiàn)代中獸醫(yī)研究院，鄭州 450002；4. 山東鑫德慧生物科技有限公司，山東鄆城 274700)

0 引 言

【研究意義】豬小腸是動物機體中直接參與消化、吸收、轉(zhuǎn)運的器官，可直接與腸道內(nèi)部微生物及其產(chǎn)物直接接觸。腸道黏膜是抵抗病原微生物入侵的第一道防線，而腸上皮細(xì)胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，其位于機體與腸腔內(nèi)環(huán)境的交界處，保護(hù)腸道免受損傷。在機體機能正常的情況下，腸上皮細(xì)胞處于一種穩(wěn)定的環(huán)境下，而當(dāng)機體處于不佳的情況下時，腸上皮細(xì)胞受到損傷，容易產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[1]。有效保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受損傷對提高仔豬機體免疫有重要意義。【前人研究進(jìn)展】大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，可以產(chǎn)生并釋放內(nèi)毒素，容易引起斷奶仔豬腹瀉和水腫等疾病，對腸道損傷嚴(yán)重[2]。豆腐果苷(4-甲酰苯基-β-D-異吡喃糖苷，HEL)是一種從野生植物龍眼科植物深綠山龍眼的果實中提取的具有鎮(zhèn)痛和抗抑郁作用的活性植物單體，臨床用于治療精神神經(jīng)癥[3-6]。HEL通過ERK/CREB信號誘導(dǎo)BDNF顯著增加，降低大鼠血清CORT和促炎因子的表達(dá)，改善抑郁樣行為[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】有研究表明，黃芪多糖和橙皮苷等對豬小腸上皮細(xì)胞炎性損傷有保護(hù)作用[10，11]，但豆腐果苷豬腸上皮細(xì)胞的作用機制還未有報道。為了提高仔豬腸上皮細(xì)胞對損傷的抵抗能力，改善氧化及炎性損傷所引起的不良反應(yīng)，需要不斷提高或改善對損傷的抵抗能力。【擬解決的關(guān)鍵問題】試驗分為5組，對照組、LPS組、HEL(25、50和100 μM)+LPS組，研究HEL對細(xì)胞炎癥及氧化損傷的影響，并確定潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對照組，LPS組，HEL(上海，源葉)(25、50和100μM)+LPS組。IPEC-J2細(xì)胞接種于6孔板中，密度為2×103細(xì)胞/孔，等細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后，將HEL按不同劑量添加到細(xì)胞中預(yù)培養(yǎng)1 h，用2 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞12 h。12 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實驗處理。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

將細(xì)胞按密度1×103細(xì)胞/孔接種在96孔板中，每組設(shè)3個重復(fù)，HEL(25、50和100 μM)和LPS(2 μg/mL)分別刺激細(xì)胞12 h，等處理時間結(jié)束后，將舊培養(yǎng)液除去，更換含有10%CCK-8試劑的DMEM培養(yǎng)液，2 h后用酶標(biāo)儀(Thermo公司)在450 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.2 qRT-PCR

用trizol提取細(xì)胞中總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green 染料法進(jìn)行TNF-α、IL-1β和IL-6的測定，通過公式2-ΔΔCt計算其各自的表達(dá)量。表1

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的檢測

取細(xì)胞樣品，按試劑盒說明書(南京，建成)測定丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.2.4 ELISA

使用ELISA試劑盒(Bio-Swamp)將收集的細(xì)胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)水平的測定。每組設(shè)3個重復(fù)，使用酶標(biāo)儀在450 nm下測定每孔的吸光值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以Means±SEM的形式表示，并用Student's t test、Two-way ANOVA分析各組數(shù)據(jù)之間差異性，#P<0.05表示與對照組相比差異顯著，*P<0.05表示與LPS組相比差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEL和LPS對細(xì)胞毒性的影響

研究表明，HEL不同劑量組和LPS對IPEC-J2細(xì)胞無毒性作用。圖1

圖1 HEL和LPS細(xì)胞毒性變化Fig.1 Effects of Hel and LPS on the cytotoxicity of IPEC-J2 cells

2.2 HEL對炎性因子表達(dá)水平的影響

研究表明，LPS會顯著升高TNF-α、IL-β和IL-6的表達(dá)水平，而HEL會顯著降低LPS所刺激的TNF-α、IL-β和IL-6的表達(dá)水平。圖2

圖2 不同添加劑量HEL下TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平變化Fig.2 Effect of HEL on the expression of inflammatory factors

2.3 HEL對抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的影響

研究表明，LPS會顯著降低抗氧化酶SOD和CAT的活性，而HEL則會顯著增高LPS所引起的SOD和CAT的活性。LPS會升高氧化產(chǎn)物MDA的活性，HEL會顯著降低LPS所引起的MDA的活性。圖3

圖3 不同添加劑量HEL下SOD，CAT和MDA變化Fig.3 Effect of HEL on SOD, CAT and MDA

2.4 HEL對炎性及氧化相關(guān)蛋白的影響

研究表明，LPS會顯著提高Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)量，而與LPS組相比，HEL治療組中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)量會進(jìn)一步升高。與LPS組相比，HEL治療組會顯著降低TNF-α、IL-β和IL-6蛋白的表達(dá)水平。圖4

圖4 不同添加劑量HEL下TNF-α、IL-1β、IL-6、Nrf2和HO-1蛋白變化Fig.4 Effects of HEL on TNF-α, IL-1 β, IL-6, Nrf2 and HO-1 proteins

3 討 論

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，是內(nèi)毒素的一種，是一種典型的腸毒素，對宿主具有毒性作用，常用于細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥模型的建立[10,11]。LPS誘導(dǎo)引起的急性肺損傷，探討Ficolin A通過激活補體對急性肺損傷的保護(hù)作用；LPS誘導(dǎo)大鼠炎癥和氧化應(yīng)激引起的認(rèn)知障礙，分析維生素D3在這過程中所發(fā)揮的作用機制[12]。腸道通透性的改變可能是LPS外周循環(huán)轉(zhuǎn)運的潛在觸發(fā)因素[13]。LPS參與細(xì)胞或機體多種模型的建立，試驗成功構(gòu)建LPS引起的細(xì)胞氧化及炎性損傷模型以進(jìn)一步探討相關(guān)機制。

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，是調(diào)控機體細(xì)胞、組織及器官中氧化還原平衡的主要組成部分，受Keap1的調(diào)控，當(dāng)Nrf2被激活后會入核，進(jìn)而與ARE結(jié)合，啟動下游一系列解毒和抗氧化因子和蛋白的表達(dá)(如HO-1)[14,15]。HO-1又稱為熱休克蛋白，可以被多種刺激激活，如氧化損傷等，其表達(dá)對細(xì)胞具有較強的保護(hù)作用。試驗研究發(fā)現(xiàn)，HEL對LPS所引起的氧化損傷具有保護(hù)作用。Nrf2和HO-1蛋白的活化會進(jìn)一步引起一些列抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的變化，會抗氧化酶SOD和CAT的活性，降低抗氧化產(chǎn)物MDA的含量，增強對細(xì)胞的保護(hù)作用，降低氧化應(yīng)激所引起的損傷。實驗研究發(fā)現(xiàn)，LPS組的變化如前論述相似，HEL治療組會顯著降低LPS所引起的Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)量，會增強SOD和CAT的活性及減弱MDA的含量。HEL會緩解LPS所引起的IPEC-J2細(xì)胞的氧化損傷。

炎癥反應(yīng)需要一個復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄程序的激活，這是細(xì)胞類型和刺激特異性的，涉及數(shù)百個基因的動態(tài)調(diào)節(jié)。在炎癥組織中，免疫系統(tǒng)的實質(zhì)細(xì)胞和浸潤細(xì)胞中基因表達(dá)都發(fā)生了廣泛的變化[18]。在細(xì)胞水平上，炎癥的基礎(chǔ)是復(fù)雜的基因表達(dá)程序的部署，包括數(shù)百個基因，并在主要刺激后幾分鐘內(nèi)被激活[19]。TNF-α、IL-1β和IL-6是常見的參與炎性反應(yīng)的重要炎性細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-6屬于促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)多種細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進(jìn)而開始急性和慢性炎性反應(yīng)過程。TNF-α、IL-1β和IL-6在炎癥發(fā)生的不同階段表達(dá)的先后時間不一樣，協(xié)同參與炎性反應(yīng)進(jìn)程，具有重要的局部和全身免疫效應(yīng)。研究選擇TNF-α、IL-1β和IL-6三個與炎性反應(yīng)關(guān)系最密切的指標(biāo)進(jìn)行觀察，HEL會在mRNA及蛋白水平分別降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量。Zhang Y等[20]研究發(fā)現(xiàn)HEL對炎性反應(yīng)具有一定的抑制作用，且與我們的研究結(jié)果相似。HEL除了用于神經(jīng)衰弱的催眠、鎮(zhèn)靜和治療外，HEL對CCl4誘導(dǎo)的肝損傷還具有保護(hù)作用[21]，HEL可改善慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激大鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力及cAMP/PKA/CREB信號活動[7]。HEL還具有對大鼠慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激模型的抗抑郁作用[9]?？傊?，HEL在豬腸上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，但HEL還有眾多其他有價值的功能需要去進(jìn)一步探討和發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié) 論

HEL會顯著降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6在mRNA水平的表達(dá)；LPS會顯著提高氧化相關(guān)蛋白(Nrf2和HO-1)的表達(dá)和抗氧化酶(SOD和CAT)的活性；HEL會緩解LPS所引起的IPEC-J2細(xì)胞的氧化及炎性損傷，一定程度上保護(hù)細(xì)胞免受傷害。