陸小雙，張夢潔，韓萬里，龍遺磊，劉鵬飛，陳全家，曲延英，鄧曉娟

(新疆農業(yè)大學農學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】棉花枯萎病病原菌為尖鐮孢萎蔫專化型(Fusariumoxysporum.f.sp.Vasinfectum(Atk.) Snyder and Hansen)，屬于土傳維管束病害，該病菌在土壤中存活年限長，一般在苗期或現蕾期出現發(fā)病高峰，該病的發(fā)生受多種因素的影響，防治起來困難[1-2]?！厩叭搜芯窟M展】2014～2018年5年間我國棉花枯萎病的平均發(fā)病面積為36.42×104hm2·次，造成19.70%的產量損失[3]。施用生物有機肥能夠降低棉花枯萎病的發(fā)病率，增產約3.1%～10.8%，但增加栽培成本[4]。【本研究切入點】輪作倒茬的方式雖然可以有效抑制棉花枯萎病的發(fā)生，但也受耕地資源限制[5]。棉花抗病新品種的選擇和培育是最為有效的解決途徑之一[6]。傳統(tǒng)大田育種方法不僅周期較長，傳統(tǒng)的病圃鑒定耗時耗力且準確性較差[7]，分子標記技術的成熟與發(fā)展為棉花抗病品種選育提供了新的技術支持[8]。【擬解決的關鍵問題】鑒定204份海島棉種質資源，分析獲得的海島棉抗病基因SSR分子標記，篩選獲得關聯的海島棉抗枯萎病分子標記，為棉花分子標記輔助育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為以 204 份海島棉材料構成的自然群體，由新疆農業(yè)大學農學院作物遺傳育種實驗室提供。

菌種為尖孢鐮刀菌七號生理小種，由新疆農業(yè)大學農學院提供。表1

表1 204份海島棉材料來源Table 1 The origin regions of 204 sea island cotton accessions

在新疆農業(yè)大學農學院棉花培養(yǎng)室室內鑒定棉花枯萎病抗性。將棉花材料種在直徑約為10 cm的營養(yǎng)缽里，每缽種1個材料，每缽播種5粒種子，3次重復，掛牌標記。采用一般肥水管理。

在新疆農業(yè)大學農學院植物病理系棉花病害研究室制備馬鈴薯液體培養(yǎng)基。將挑取枯萎病菌單菌落接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)1周以上，用細胞計數器計數菌液濃度達到1×107個/cm2時備用。

1.2 方 法

1.2.1 海島棉資源群體枯萎病抗性的室內鑒定

待棉花幼苗2片子葉展平時，用滅過菌的剪刀將營養(yǎng)缽底部剪掉1 cm左右，然后放在含有枯萎病菌的培養(yǎng)皿中沾取菌液后，放回原處。在接種3周后開始調查和統(tǒng)計室內病情，待病情穩(wěn)定后調查發(fā)病率。

棉花枯萎病株分級標準采用國家統(tǒng)一標準[9]。表2

表2 棉花枯萎病級劃分標準Table 2 The classification standard of cotton Fusarium wilt

采用病情指數來鑒定棉花株系的枯萎病抗性，參考有關資料，將鑒定材料分為免疫(I)、高抗(HR)、抗病(R)、耐病(T)和感病(S)5個等級[10]。表3

表3 棉花材料抗病性劃分標準Table 3 Criteria for disease resistance of cotton materials

1.2.2 SSR分子標記開發(fā)、鑒定和評價

利用黃啟秀等[11]報道的5個海島棉抗枯萎病基因，通過primer5.0設計SSR分子標記40對。以4個抗病材料和3個感病材料(抗病材料為06-146、埃棉2號、DJ-07-136和Pimas-7，感病材料為新海14號、海92-3和埃及棉424)對SSR引物進行初步篩選。獲得的特異條帶在海島棉資源群體中分析，驗證分子標記的適用性。

以棉花幼苗真葉期葉片為材料，用改進的 CTAB 法提取DNA[12]。所用 SSR引物由新疆昆泰銳生物技術有限公司合成。PCR 反應程序：95℃ 預變性 5 min； 30 個循環(huán)( 94℃ 變性 30 s，58℃ 退火溫度 45 s，延伸30 s)； 72℃ 延伸 10 min；4℃ 保存。使用濃度為 8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳對 PCR 擴增產物進行分離，待跑完電泳以后，銀染依據郭大龍等[13]方法照相保存。表4

表4 SSR引物及基因來源Table 4 SSR primers and gene sources

2 結果與分析

2.1 群體室內抗病性鑒定結果

研究表明，204份海島棉資源材料中，高抗材料(HR)2份(中國新疆和內地各1份)，占所測定棉花材料的0.98%；抗病材料(R)34份(中國內地11份，蘇聯10份，中國新疆7份，美國2份，未知4份)，占所測定棉花材料的16.67%；耐病材料(T)107份(中國新疆29份，前蘇聯26份，中國內地22份，埃及10份，美國8份，未知12份)，占所測定棉花材料的52.45%；感病材料(S) 61份(中國內地18份，中國新疆10份，前蘇聯9份，美國5份，埃及5份，阿爾巴尼亞2份，未知12份)，占所測定棉花材料的29.90%；無免疫材料。表5

表5 海島棉材料的室內鑒定結果Table 5 Indoor identification results of island cotton materials

2.2 分子標記篩選

研究表明，共有6對引物與抗病性具有多態(tài)性。CHS-04和CHS-05重復性較強。引物CHS-04擴增下抗病品種06-146、DJ-07-136、埃棉2號和Pimas-7擴增出一條特意差異帶，條帶大約為1 350 bp，而感病品種新海14號和埃及棉424未能擴增出這條帶，而是400 bp的帶。引物CHS-05擴增下感病品種新海14號、海92-3和埃及棉424擴增出兩條差異帶，大小約為400 bp 和 630 bp，而抗病材料DJ-07-136擴增出一條帶，約為630 bp，06-146、Pimas-7和埃棉2號均未能擴增出這兩條帶。圖1，表6

注：A：CHS-04 PCR 擴增產物M：D2000 Maker；1：新海14號；2：06-146；3：埃棉2號；4：DJ-07-136；5：Pimas-7；6：海92-3；7：埃及棉424 B：CHS-05 PCR 擴增產物M：D2000 Maker；a：新海14號；b：06-146；c：埃棉2號；d：DJ-07-136；e：Pimas-7；f：海92-3；g：埃及棉424

表6 引物篩選PCR擴增電泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

續(xù)表6 引物篩選PCR擴增電泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

2.3 抗病性分子標記與枯萎病抗性關聯鑒定

研究表明，引物CHS-04擴增抗病條帶與抗病材料一致率為1；與感病材料一致率較低，為0.67。引物CHS-05擴增感病條帶與感病材料一致率達到1；與抗病材料一致率較低，為0.875。表7

表7 抗病材料普遍條帶與材料抗性的一致率Table 7 Consistent rate of common strips and resistance of resistant materials

2.4 抗病關聯分子標記的評價

研究表明，引物CHS-04擴增條帶與群體材料一致率介于41.67%～52.94%，平均值為46.67%。引物CHS-05擴增條帶與群體材料一致率介于30.39%～54.68%，平均值為35.78%。圖2，圖3，表8

注：M：D2000Maker；1：蘇K202；2：新海35號；3：吐77-104；4：躍61；5：孔雀200；6：吉1；7：NMGB-16；8：司-6002；9：巴1248；10：雞爪海島棉長；11：躍51；12：90199；13：云南4號；14：海92-2；15：巴3119；16：9078依；17：軍海1號；18：墨-1413；19：阿101；20：吉2；21：新海34號；22：新海27號；23：910u；24：7059；25：長絨；26：5917；27：吐82-6-17；28：吉扎31；29：NMGB-2；30：新海36號；31：海島棉3；32：K366；33：NMGB-10；34：C-6019；35：7051；36：H3549，下同

圖3 引物CHS-05擴增部分群體材料PCR產物電泳Fig.3 PCR product electrophoresis of primers CHS-05 amplified parts of the population material

表8 引物CHS-04、CHS-05擴增部分群體材料PCR條帶一致率Table 8 PCR band consistency rate of primers CHS-04 and CHS-05 amplified parts of the population materials

3 討 論

3.1 類黃酮代謝途徑與棉花枯萎病抗病基因的關聯

目前已知的類黃酮化合物結構有6 000多種，當存在微生物侵染時，類黃酮作為植保素在植物體內積累以保護植物，可以阻止植株真菌孢子發(fā)芽[14]。查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是類黃酮合成途徑中的第1個關鍵結構酶，催化生成的查爾酮是多種類黃酮代謝途徑的前體，CHS超基因家族起源古老，而查爾酮合成酶是CHS基因家族的核心酶[15]。CHS基因涉及植物的花色、育性和逆境反應等多種功能[16]。趙學榮等[17]從苦蕎中克隆獲得FtCHS1基因側翼序列PFtCHS1，4℃處理后苦蕎葉子中FtCHS1基因的表達量在24 h內呈現“緩慢下降-急劇上升-驟然下降”的變化，PFtCHS1可響應低溫脅迫。馬立功等[18]從向日葵耐病品種龍食葵2號中克隆出HaCHS，研究發(fā)現在低溫、創(chuàng)傷和JA誘導后HaCHS基因表達量顯著提高，推測HaCHS可能在植物逆境脅迫應答中起作用。王爽[19]以抗病品種灰皮支黑豆和感病品種williams82為材料，用大豆胞囊線蟲3號生理小種進行侵染脅迫，試驗顯示抗病品種灰皮支黑豆中CHS5、CHS7、CHS8、CHS9基因5dpi時均明顯上調表達，初步說明CHS基因在抗病品種抗性機制中的重要作用。黃啟秀[11]研究顯示，接種病菌后的CHS基因在海島棉枯萎病抗病材料中表達活躍，CHS基因在海島棉抗枯萎病中起著作用。

3.2 SSR分子標記技術在棉花抗病基因開發(fā)中的應用

SSR( Simple sequence repeat) 即簡單序列重復，又稱微衛(wèi)星DNA，指的是一般1～6個核苷酸為重復單位串聯組成的簡短序列[20]。SSR分子標記技術因其對模板DNA要求低，過程簡單，基因組覆蓋范圍廣，再現性好等諸多特點而應用廣泛[21]。甄瑞等[22]以高抗黃萎病海島棉與高感黃萎病陸地棉品系的F2群體為材料，采用SSR分子標記篩選得到海島棉黃萎病抗性基因連鎖分子標記BNL3255208，位于第5號染色體的短臂上。杜威世等[23]以高抗黃萎病海島棉與高感黃萎病陸地棉品系的F2單株群體作為材料，利用SSR分子標記檢測到1個黃萎病抗性的QTL位點,位于SSR標記位點BNL1414和BNL3556之間。陳勛基等[24]以高抗枯萎病陸地棉與海島棉感病品系的F2∶3群體為材料，利用SSR標記構建連鎖圖譜，共檢測到4個與棉花枯萎病相關QTL效應，分別位于3、15、23和26連鎖群上。朱永軍等[25]以高感枯萎病海島棉品種新海21號與高抗枯萎病海島棉品系HK237構建的P1、P2、F1、F2、F2:3、BC1為材料，利用BSA法對2000對SSR引物進行篩選并進行遺傳連鎖分析，篩選得到分子標價NAU3240與抗枯萎病基因位點之間緊密連鎖，兩者之間的遺傳距離為19 cm，該標記位于棉花D11(Chr.21)染色體區(qū)域。試驗采用傳統(tǒng)方法設計SSR標記引物，所獲得的與海島棉枯萎病抗病基因相關聯SSR分子標記是否與前人研究相同，還需對其所處基因連鎖群進行進一步定位比較后才能確定。

4 結 論

使用由海島棉枯萎病抗病相關基因設計出的40對SSR引物，對204份海島棉種質資源進行PCR擴增，有2對引物擴增出特異條帶，均來源于類黃酮代謝途徑CHS基因。引物CHS-04和CHS-05擴增條帶與群體抗病性的高一致率，2對引物可以作為海島棉枯萎病抗性的分子標記鑒定指標。