王 乾，張 靜，郁成禮，包龍龍，蔡 旭，蔣文華，黃 丹，盛偉琪，朱曉麗，周曉燕，柏乾明

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，復(fù)旦大學(xué)病理研究所，上海 200032

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和死亡率分別居全球第3位和第4位，12%～ 15%的CRC患者存在錯(cuò)配修復(fù)缺陷（deficient mismatch repair，dMMR），表現(xiàn)為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）［1-2］。遺傳性非息肉病性CRC（hereditary nonpolyposis CRC，HNPCC），也稱為林奇綜合征，其特征為MMR基因通常包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2胚系突變［3］。然而，大多數(shù)MSI-H病例是散發(fā)性的，通常是由于MLH1的表觀遺傳沉默所導(dǎo)致的［4］。目前，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南推薦在晚期CRC患者中常規(guī)檢測MMR/MSI狀態(tài)，用以篩查林奇綜合征并預(yù)測實(shí)體瘤對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療反應(yīng)。

常規(guī)MMR/MSI檢測中，多重?zé)晒饩酆厦告湻磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）毛細(xì)管電泳法檢測MSI狀態(tài)被視為金標(biāo)準(zhǔn)，免疫組織化學(xué)（immunochemistry，IHC）因其物美價(jià)廉通常被臨床選擇用于dMMR的篩查。然而，由于MMR系統(tǒng)存在功能補(bǔ)償，當(dāng)IHC檢測MMR蛋白發(fā)生缺失時(shí)，未必會導(dǎo)致MSI升高，仍可呈微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）狀態(tài)；反之，當(dāng)編碼MMR蛋白的基因發(fā)生錯(cuò)義突變時(shí)，MMR蛋白功能異常，但并未影響其抗原結(jié)構(gòu)，在這種情況下，IHC仍能夠檢測到MMR蛋白的表達(dá)，但其MMR功能是異常的，MSI的檢測結(jié)果為MSI-H。因此，在臨床工作中，5%～ 10%的CRC病例IHC與PCR檢測MMR/MSI結(jié)果會出現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，給臨床醫(yī)師和患者帶來諸多困惑［5-7］。此外，由于IHC方法的實(shí)驗(yàn)室間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)差異以及所使用的抗體和病理學(xué)家判讀水平的差異均可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差，所以，精確度更高的Promega MSI檢測系統(tǒng)在臨床研究中得到廣泛認(rèn)可［8-9］。然而，Promega MSI檢測系統(tǒng)需要比較非腫瘤正常組織微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因圖譜，并且檢測周期在臨床實(shí)踐中為3～ 5 d，給臨床治療，尤其是病情嚴(yán)重惡化的晚期腫瘤患者帶來諸多不便［10］。因此，國內(nèi)迫切需要用于MSI快速檢測的自動化平臺。

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)（比利時(shí)Biocartis公司）通過集成DNA提取、熱循環(huán)、熒光檢測和結(jié)果報(bào)告于一體，為臨床MSI檢測提供快速解決方案。全自動工作流程僅需2.5 h即可確定MSI狀態(tài)，并且不需要非腫瘤正常組織作為對照。IdyllaTMMSI檢測在白種人群CRC患者中已被廣泛驗(yàn)證為快速、準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)方法，但在中國CRC患者中的應(yīng)用尚缺乏足夠的臨床依據(jù)［11-13］。本研究通過與傳統(tǒng)IHC和Promega MSI檢測系統(tǒng)比較，評估IdyllaTMMSI檢測在中國CRC患者中的臨床可靠性。

1 資料和方法

1.1 入組病例

回顧性收集2017年3月—2019年3月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科經(jīng)IHC或Promega MSI檢測為dMMR/MMR完整（proficient MMR，pMMR）或MSI-H/MSS的87例CRC患者。為更好地驗(yàn)證IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)的性能指標(biāo)，優(yōu)先選擇dMMR/MSI-H的CRC患者，包括56例dMMR/MSI-H和31例pMMR/MSS CRC患者。所有樣本均來自CRC根治性手術(shù)切除標(biāo)本，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為腺癌。所有入組樣本補(bǔ)齊MMR蛋白（包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）IHC檢測或Promega MSI檢測，并全部進(jìn)行IdyllaTMMSI檢測。通過與Promega MSI/IHC比較，評估IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異度。當(dāng)檢測結(jié)果不一致時(shí)，進(jìn)行必要的重復(fù)檢測，或通過顯微切割富集腫瘤組織后再重復(fù)檢測。本研究已通過復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審查與批準(zhǔn)，所有入組患者均已簽署知情同意書。

1.2 IHC檢測方法

獲取所有患者腫瘤組織4 μm厚石蠟包埋切片進(jìn)行MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）IHC檢測。所有4個(gè)MMR標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞核中均有表達(dá)時(shí)，判定為pMMR；4個(gè)MMR標(biāo)記中任何一個(gè)標(biāo)記在腫瘤細(xì)胞核中表達(dá)完全缺失時(shí)，則判定為dMMR。所有IHC結(jié)果均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片。每張切片上均設(shè)置合適的陰性、陽性對照。

1.3 Promega MSI檢測方法

Promega MSI檢測系統(tǒng)（美國Promega公司）是通過檢測5種單核苷酸標(biāo)記（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27），并與正常對照組織比較，當(dāng)≥2/5的單核苷酸標(biāo)記所對應(yīng)的峰型或位置發(fā)生改變時(shí)，判定為MSI-H；僅1個(gè)標(biāo)記發(fā)生改變時(shí)，判定為低度MSI（MSI-low，MSI-L）；無標(biāo)志物發(fā)生改變時(shí)，判定為MSS［14］。

1.4 IdyllaTM MSI檢測方法

IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)包括1組7種新型標(biāo)志物（ACVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A、SULF2）。具體操作步驟依據(jù)說明書與實(shí)驗(yàn)室相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范文件進(jìn)行。簡單地說，將腫瘤用40%甲醛溶液固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織連續(xù)切取5張5～ 10 μm厚度切片，第1、5張用于H-E染色，并評估腫瘤細(xì)胞百分比。第2～ 4張切片放置于去離子水浸濕的濾紙上，并將其平鋪至載玻片上，然后，在上層覆蓋同樣被去離子水浸濕的濾紙構(gòu)成“三明治”結(jié)構(gòu)，將其轉(zhuǎn)入IdyllaTMMSI檢測試劑盒內(nèi)，準(zhǔn)備上機(jī)。上機(jī)時(shí)，掃描IdyllaTMMSI檢測試劑盒上的二維碼，輸入腫瘤組織病理學(xué)編號后放入IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)中，點(diǎn)擊開始，2.5 h后即可讀取結(jié)果。每個(gè)標(biāo)記單獨(dú)評分，以0～ 1之間的分值表示，當(dāng)分值≤0.5時(shí)，報(bào)告為“未檢測到突變”；當(dāng)分值＞0.5時(shí)，報(bào)告為“檢測到突變”；當(dāng)某孔指標(biāo)無有效擴(kuò)增信號時(shí)，報(bào)告為“無效”。7個(gè)MSI新型標(biāo)志物中≥5個(gè)顯示為有效的擴(kuò)增信號時(shí)，則認(rèn)為該測試結(jié)果有效。如果7個(gè)標(biāo)志物中的2個(gè)或2個(gè)以上顯示為“檢測到突變”（陽性），則該例MSI檢測結(jié)果判定為MSI-H，如果7個(gè)標(biāo)志物中少于2個(gè)陽性，則判定為MSS。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩組間比較檢測結(jié)果的差異采用t檢驗(yàn)，多組間比較檢測結(jié)果的差異采用χ2檢驗(yàn)。使用SPSS Statistics 23.0版對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 87例CRC患者的臨床病理學(xué)特征及IHC、Promega和IdyllaTM 3種方法檢測MMR/MSI狀態(tài)的比較

本研究中87例CRC患者的臨床病理學(xué)特征見表1。其中55例（63.2%）患者為男性，61例（70.1%）患者的發(fā)病年齡＞50歲，組織病理學(xué)診斷均為腸腺癌，86例（98.9%）患者的腫瘤含量≥20%。

應(yīng)用IHC、Promega和IdyllaTM3種方法檢測MMR/MSI狀態(tài)，結(jié)果顯示，IHC和Promega兩種方法的檢測結(jié)果完全一致，其中56例被確定為dMMR/MSI-H，31例為pMMR/MSS。dMMR/MSI-H的CRC患者更常見于Ⅱ期（75.7%，28/37）、右側(cè)結(jié)直腸腺癌（82.2%，37/45）中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IHC結(jié)果顯示，在dMMR CRC患者中，MLH1/PMS2共缺失最常見，高達(dá)76.8%（43/56），其次為MSH2/MSH6共缺失，為23.2%（13/56），本研究中未見其他dMMR缺失（表1）。然而，其中4例dMMR/MSI-H患者被IdyllaTMMSI系統(tǒng)診斷為MSS，1例pMMR/MSS患者被診斷為MSI-H。若以IHC/Promega為標(biāo)準(zhǔn)，IdyllaTMMSI系統(tǒng)的診斷靈敏度為92.9%（52/56），特異度為96.8%（30/31），總體一致率達(dá)94.3%（82/87）。

表1 87例中國CRC患者臨床病理學(xué)特征及IHC、Progema和IdyllaTM 3種方法檢測MMR/MSI狀態(tài)Tab.1 Clinicopathological characteristics and MMR/MSI status detected by IHC and both Progema and IdyllaTM MSI analysis in 87 cases of Chinese CRC

2.2 IdyllaTM MSI系統(tǒng)對5例不一致病例重復(fù)檢測結(jié)果

如上所述，與傳統(tǒng)IHC/Promega檢測相比，IdyllaTMMSI檢測結(jié)果有5例CRC患者的MMR/MSI狀態(tài)存在不一致，包括4例假陰性和1例假陽性。為進(jìn)一步探究不一致的原因，5例原始FFPE樣本被IdyllaTMMSI系統(tǒng)重復(fù)檢測。結(jié)果顯示，3例假陰性病例（病例17、22、26）被確定為MSI-H，1例假陽性病例（病例4）為MSS，與Promega MSI和IHC檢測結(jié)果一致，且該4例腫瘤含量 均≥20%。然而，仍有1例（病例55）MSI狀態(tài)不一致，該例腫瘤含量僅為5%。對該病例通過激光捕獲顯微切割技術(shù)富集腫瘤組織后，再次應(yīng)用IdyllaTMMSI系統(tǒng)重復(fù)檢測，結(jié)果顯示為MSI-H，與Promega MSI/IHC一致（圖1）。

圖1 腫瘤含量僅為5%的病例55的檢測流程圖Fig.1 Test flow chart of case 55 with tumor content of only 5%

2.3 IdyllaTM MSI系統(tǒng)重復(fù)性驗(yàn)證

由于IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)對5例不一致患者的兩次檢測結(jié)果存在差異，因此，IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)的可重復(fù)性需被再次驗(yàn)證。選取5例具有不同腫瘤占比（20%～ 60%不等）的原始FFPE樣本，包括4例dMMR/MSI-H和1例pMMR/MSS病例。分別獲取5張連續(xù)組織切片（第1～ 5片），其中第1片和第5片均行H-E染色，用以評估腫瘤含量，均顯示出相似的腫瘤含量。再選取第2～ 4片分別用IdyllaTMMSI系統(tǒng)進(jìn)行3次重復(fù)檢測。3次重復(fù)檢測的最終判定結(jié)果均相同，且與IHC/Promega MSI分析結(jié)果完全一致。進(jìn)一步分析IdyllaTMMSI系統(tǒng)中各標(biāo)志物的可重復(fù)性，ACVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11和RYR3 5個(gè)標(biāo)志物的分值在5例患者的3次重復(fù)中均高度相似。然而，病例39中的SEC31A標(biāo)記和病例28中的SULF2標(biāo)記所對應(yīng)的分值在3次重復(fù)中顯示出不同的結(jié)果，尤其病例28中的SULF2，第4片的MSI分?jǐn)?shù)（0.92）遠(yuǎn)高于第2、3片的分?jǐn)?shù)（0.02、0.01），詳見表2。

表2 采用IdyllaTM MSI重復(fù)性檢測分析7個(gè)新型標(biāo)志物MSI分值的變化Tab.2 The changes of MSI scores of 7 novel markers were analyzed by IdyllaTM MSI repeatability test

3 討論

本研究回顧性收集87例中國CRC患者的臨床病理學(xué)資料，經(jīng)IHC和Promega MSI分析MMR/MSI狀態(tài)，56例被判定為dMMR/MSI-H，31例為pMMR/MSS。以IHC/Promega檢測結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，IdyllaTMMSI系統(tǒng)的診斷靈敏度為92.9%，特異度為96.8%，總體一致率達(dá)94.3%。對5例檢測結(jié)果不一致的患者，應(yīng)用IdyllaTMMSI系統(tǒng)重復(fù)檢測，結(jié)果顯示，除1例腫瘤含量僅為5%的病例外，其余4例腫瘤含量≥20%的病例復(fù)核結(jié)果均與IHC/Promega完全一致。此外，選取5例伴有不同腫瘤含量（20%～ 60%）的CRC組織樣本，應(yīng)用連續(xù)組織切片對IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)的重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，3次重復(fù)檢測的結(jié)論均相同，且與IHC/Promega MSI分析結(jié)果完全一致，表明IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)在腫瘤含量≥20%的CRC中具有良好的可重復(fù)性。因此，IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)可以為臨床MSI檢測提供一種快速、可靠、全自動的解決方案，并具有較高的靈敏度、特異度和可重復(fù)性。

2017年5月，美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）正式批準(zhǔn)使用派姆單抗單藥治療具有MSI-H/dMMR的多種實(shí)體瘤［15-17］。然而，IHC和Promega MSI作為常規(guī)檢測實(shí)驗(yàn)已無法滿足快速增長的檢測需求。Promega MSI處理步驟包括脫蠟、組織裂解、DNA提取、熱循環(huán)和數(shù)據(jù)解釋等，在臨床實(shí)踐中需3～ 5 d才能完成。而IHC需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控，且醫(yī)師在判斷時(shí)存在主觀性，容易產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果，影響患者后續(xù)治療。相比之下，IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)操作方法簡便，運(yùn)行周期短（2.5 h），整個(gè)工作流程在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，可最大限度地降低污染風(fēng)險(xiǎn)。IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)選取的7種新型標(biāo)志物在高加索人、非洲人、亞洲人和美國人中均被證實(shí)存在［18］。此外，這些標(biāo)志物的探針易組合在一起，從而實(shí)現(xiàn)多重檢測［19］。同時(shí)，這些標(biāo)志物還與生物信息技術(shù)和各種緩沖系統(tǒng)兼容，讀數(shù)與數(shù)學(xué)變換算法兼容，以最大限度地區(qū)分MSS與MSI-H［20］。

本研究中IdyllaTMMSI系統(tǒng)首次檢測87例CRC樣本時(shí)，有5例結(jié)果與傳統(tǒng)IHC/Promega方法不一致，其中4例在IdyllaTM系統(tǒng)重復(fù)檢測中得以糾正，但仍有1例腫瘤含量僅為5%的病例，IdyllaTMMSI檢測結(jié)果呈假陰性。通過激光捕獲顯微切割技術(shù)富集腫瘤組織后，IdyllaTMMSI檢測再次復(fù)核的結(jié)果最終被糾正，呈MSI-H狀態(tài)。進(jìn)一步應(yīng)用5例伴有不同腫瘤含量的連續(xù)組織切片評估IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)可重復(fù)性時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種新型標(biāo)志物均具有較好的可重復(fù)性，且5例樣本的3次重復(fù)性檢測的結(jié)論均完全一致，但個(gè)別樣本中標(biāo)志物SEC31A和SULF2的MSI分值出現(xiàn)較大波動，可能與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)［21］。這些研究結(jié)果提示在臨床實(shí)際工作中應(yīng)用IdyllaTM系統(tǒng)檢測MSI狀態(tài)時(shí)，應(yīng)特別注意如下幾種情況：①當(dāng)送檢樣本中腫瘤占比小于該系統(tǒng)推薦的閾值（20%）時(shí)［22］，需對腫瘤細(xì)胞富集后再行后續(xù)檢測；② 當(dāng)該系統(tǒng)檢測結(jié)果與常規(guī)IHC或Promega等檢測結(jié)果出現(xiàn)不一致時(shí)，應(yīng)再次復(fù)核或用第3種方法驗(yàn)證；③當(dāng)該系統(tǒng)結(jié)果提示7種標(biāo)志物中1～ 3種標(biāo)志物發(fā)生突變時(shí)，即結(jié)論為臨界陽性或陰性時(shí)，應(yīng)仔細(xì)復(fù)核原始數(shù)據(jù)中各標(biāo)志物的分值，必要時(shí)再次重復(fù)檢測；④ 盡管對于MSI-L的生物學(xué)意義仍存在爭議，但I(xiàn)dyllaTM系統(tǒng)不能區(qū)分MSS和MSI-L［23］，后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注。

雖然本研究結(jié)果在相對較小的樣本量中得到驗(yàn)證，仍存在一定的局限性，但整體而言，對于腫瘤含量≥20%的CRC患者，IdyllaTMMSI檢測系統(tǒng)可以為臨床MSI檢測提供一種快速、可靠、全自動的解決方案，并具有較高的靈敏度、特異度和可重復(fù)性，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。