成意財(cái)，杜振華，范志娟，馮 嵐，曹鵬博，周鋼橋

1.南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421000；

2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心，北京 100850；

3.天津市武警特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，天津 300160；

4.天津市第三中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（?？疲?，天津 300170

世界衛(wèi)生組織2020年發(fā)布的全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率排名第6位、死亡率排名第3位的消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。其中，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的75%～85%［1］。在中國(guó)，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是與HCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的最主要風(fēng)險(xiǎn)因素，約有85%的HCC患者有HBV感染史［2］。超過(guò)70%～80%的患者確診時(shí)已是中晚期，并且晚期HCC切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%～70%［3］。最近研究［4］顯示，若能實(shí)現(xiàn)HCC的早期診斷，可將患者的5年生存率提高到50%～75%。因此，研發(fā)更為有效的HCC診斷方法或策略，提高高危人群的早診率，將有望提高HCC患者的生存率。

外泌體是一種直徑為40～200 nm、由細(xì)胞內(nèi)多囊泡胞內(nèi)體（multi-vesicular endosome，MEV）成熟過(guò)程中膜向內(nèi)出芽形成的具有脂質(zhì)雙分子層的腔內(nèi)小泡［5］。近年來(lái)的研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，外泌體中包含的蛋白質(zhì)、核酸和脂類物質(zhì)等可以作為癌癥的診斷和（或）預(yù)后標(biāo)志物，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過(guò)HCC患者血漿外泌體的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)定性和定量分析，系統(tǒng)篩選可能作為HCC診斷的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，并在獨(dú)立的HCC人群隊(duì)列中對(duì)其潛在的診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究人群及其樣本采集

研究人群包括發(fā)掘人群和驗(yàn)證人群。其中發(fā)掘人群包括4例HCC患者和4名健康對(duì)照著（healthy control，HC），驗(yàn)證人群包括56例HCC患者、20例肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者和48名HC（表1）。HCC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）指南［8］。HCC的分級(jí)參照巴塞羅納臨床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）分級(jí)系統(tǒng)［9］。LC通過(guò)病理學(xué)活檢或兩種影像學(xué)檢查（超聲檢查合并計(jì)算機(jī)體層成像或磁共振成像）確診。HC為無(wú)肝病或其他系統(tǒng)性疾病史的個(gè)體。上述HCC、LC和HC的外周靜脈全血樣本均于2018年8月1日—2019年9月1日在天津市第三中心醫(yī)院采集。采集所有研究對(duì)象的外周靜脈全血4 mL，然后，在4 ℃條件下500×g離心10 min，收集血漿，立即儲(chǔ)存于-80 ℃超低溫冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。本研究由天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

表1 研究對(duì)象的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of participants

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，F(xiàn)LOT1抗體、兔抗CD48抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗鼠IgG-HRP、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、蛋白預(yù)染Marker、抗熒光淬滅封片液及電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）液均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，CD63抗體和CD48蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，鼠抗CD48購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，馬血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，二硫代蘇糖醇、碘乙酰胺、重碳酸鹽三乙銨均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，多聚甲醛溶液購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

96孔酶標(biāo)板和Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，超純水系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司，醫(yī)用超低溫冷凍冰箱購(gòu)自海爾集團(tuán)，離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，尺寸排阻色譜柱購(gòu)自新西蘭Izon公司，透射電子顯微鏡購(gòu)自日本HITACHI公司，納米粒子跟蹤分析儀購(gòu)自德國(guó)Particle Metrix公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司，SunriseTM酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體的分離純化

采用尺寸排阻色譜法提取血漿中的外泌體，具體方法如下：首先，在4 ℃條件下，將500 μL血漿樣本依次1 500×g離心10 min、10 000×g離心20 min，留取上清液。然后，將離心后的血漿加注到qEV外泌體分離柱中，通過(guò)緩沖液洗脫收集第7～9餾分（0.5 mL/餾分）。合并餾分后，在4 ℃條件下140 000×g離心4 h，去上清液。最后，用60 μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）重懸外泌體顆粒、備用。

1.2.2 外泌體的鑒定

1.2.2.1 外泌體的透射電子顯微鏡檢測(cè)

滴加上述20 μL分離純化的外泌體懸液于載物銅片上，室溫靜置10 min，用濾紙吸干。然后，滴加10 μL的4%磷鎢酸溶液負(fù)染90 s，在白熾燈下烤干。最后，采用透射電子顯微鏡觀察血漿外泌體的形態(tài)。

1.2.2.2 外泌體蛋白的提取及定量

取20 μL外泌體懸液，加入180 μL蛋白裂解液，冰上靜置5 min，渦旋振蕩。在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min后留取上清。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白質(zhì)水平

取25 μg外泌體蛋白上樣，Western blot溫育、電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。Western blot溫育一抗為anti-FLOT1（1∶1 000，ab41927）和anti-CD63（1∶1 000，25682-1-AP），4 ℃溫育過(guò)夜，第2天洗滌3次，然后與相應(yīng)種屬的二抗（CW0102M）室溫溫育1 h，最終顯影、拍照，并分析結(jié)果。

1.2.2.4 外泌體的粒徑分析

取20 μL分離純化的外泌體懸液，用PBS（經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過(guò)濾）稀釋成1 mL，用1 mL注射器向樣品池緩慢上樣。采用納米粒子跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體的大小。

1.2.2.5 外泌體蛋白的酶解

首先，采用放射免疫沉淀裂解液（10 μL蛋白酶抑制劑和10 μL磷酸酶抑制劑）裂解外泌體懸液，得到總蛋白。冰凍20 min后在冰上超聲 2 min，然后14 000×g離心10 min，收集上清液。隨后，將每個(gè)樣品提取物（20 μg蛋白質(zhì)）用 5 mmol/L的二硫代蘇糖醇在37 ℃下還原1 h，再在室溫、避光條件下用20 mmol/L碘乙酰胺烷基化10 min。處理后的樣品用25 mmol/L重碳酸鹽三乙銨稀釋4倍，然后，在37 ℃條件下下用胰蛋白酶（V528A）消化過(guò)夜。最后，置于冷凍干燥機(jī)裝置中干燥樣品。

1.2.3 質(zhì)譜分析

通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，將每個(gè)樣品重新溶解于緩沖液A（20%乙腈和0.1%甲酸）中，并將其裝入U(xiǎn)HVPenning IKR270短分析柱（內(nèi)徑75 μm，孔徑100 ?）中，以12 μL/min的流速分離4 min（緩沖液B：0.1%甲酸和100%乙腈）后，再以0.3 μL/ min的恒定流速運(yùn)行洗脫梯度（洗脫0～11 min，4%～10%緩沖液B；洗脫11～88 min，10%～25%緩沖液B；洗脫88～98 min，25%～50%緩沖液B；洗脫98～102 min，50%～99%緩沖液B）分離多肽。質(zhì)譜儀在2 kV電噴霧下以正極性非數(shù)據(jù)依賴性采集模式下運(yùn)行，全掃描模式［質(zhì)荷比（m/ z）范圍為250～1 450］，每次掃描后進(jìn)行30次二級(jí)掃描，35%標(biāo)準(zhǔn)碰撞能量，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15 s。

對(duì)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)Spectronaut軟件（瑞士Biognosys公司）以UniProtKB/Swiss Prot（2018年8月發(fā)布，包含73 645條序列）為參考進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。搜索條件設(shè)置為：最多允許2個(gè)胰蛋白酶漏切位點(diǎn)，氨基甲基化設(shè)置為固定修飾，乙?；脱趸O(shè)置為可變修飾，其他參數(shù)使用默認(rèn)設(shè)置。蛋白質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為：至少檢測(cè)到3個(gè)特征肽段，P＜0.05，假陽(yáng)性率小于1%。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

采用購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣亞諾法生技股份有限公司的ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書檢測(cè)血漿中甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）的表達(dá)水平。過(guò)程如下：①將血漿樣本稀釋液和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品依次加入反應(yīng)孔中，溫育后清洗；② 向每孔中加入生物素化檢測(cè)抗體，溫育后清洗；③向每孔中加入親和素HRP，溫育后清洗；④ 向每孔中加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB），其在HRP的催化下產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，加入酸性停止液后變成黃色；⑤ 采用SunriseTM酶標(biāo)儀在450 nm處讀取反應(yīng)信號(hào)。

采用建立的ELISA方法檢測(cè)外泌體中CD48蛋白的表達(dá)水平，過(guò)程如下：①在96孔酶標(biāo)板中包被100 μL鼠抗人CD63單克隆抗體（1∶1 000，67605-1-Ig），4 ℃溫育過(guò)夜后洗滌、拍干水珠；② 向每孔中加入200 μL含0.05%吐溫-20的5%脫脂奶粉溶液，室溫溫育2 h后洗滌、拍干水珠；③向每孔中加入100 μL血漿樣本和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃下溫育2 h后洗滌、拍干水珠；④ 向每孔中加入100 μL兔抗人CD48多克隆抗體（1∶500，ab134049），37 ℃溫育2 h后洗滌、拍干水珠；⑤ 向每孔中加入100 μL結(jié)合HRP的羊抗兔IgG多克隆抗體（1∶1 000；ab205718），37 ℃溫育1 h后洗滌、拍干水珠；⑥ 向每孔加入90 μL TMB，室溫下溫育15 min后，每孔加入50 μL終止液（2 mol/ L H2SO4）；⑦ 采用SunriseTM酶標(biāo)儀在450 nm處讀取反應(yīng)信號(hào)。

1.2.5 免疫熒光

首先，取20 μL分離純化的外泌體與500 μL 2%的多聚甲醛溶液混合，并滴加在蓋玻片上固定20 min，用PBS洗滌2次，使用5%馬血清封閉外泌體30 min，用PBS洗滌2次；其次，在蓋玻片上加入400 μL的鼠抗人CD48單克隆抗體（1∶40，MAB36441）溫育20 min，用PBS洗滌2次；然后，在蓋玻片上加入400 μL的山羊抗小鼠IgG（1∶200，A28175）溫育20 min，用PBS洗滌2次；隨后，在蓋玻片上加入400 μL的抗熒光淬滅封片液；最后，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。僅用山羊抗小鼠IgG處理的外泌體作為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R4.1.2和GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較分類變量的組間差異。采用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較各組間血漿外泌體中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，并采用Benjamin-Hochberg進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估候選標(biāo)志物的診斷效能。使用Youden指數(shù)計(jì)算ROC曲線的最佳切點(diǎn)，并將其作為截?cái)嘀担?jì)算相應(yīng)的靈敏度和特異度。P（雙側(cè)檢驗(yàn)）＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體的分離和鑒定

首先采用尺寸排阻色譜法提取發(fā)掘人群中4個(gè)HCC和4個(gè)HC個(gè)體的血漿外泌體，并分別采用納米粒徑分析、透射電鏡分析和免疫印跡分析評(píng)估所提取的外泌體質(zhì)量。納米粒子跟蹤分析結(jié)果顯示，富集到的外泌體直徑為30～150 nm，其粒徑峰值約為72.25 nm，濃度約為2.19×109particles/mL（圖1A）。通過(guò)透射電鏡分析可以清晰地觀察到血漿外泌體的大小在40～150 nm之間（圖1B），形狀如“茶托形”或“橢圓形”，與外泌體的形貌特征相符。免疫印跡分析顯示，所富集的外泌體高表達(dá)特異性標(biāo)志物FLOT1和CD63（圖1C）。上述結(jié)果表明，本研究分離富集到了高質(zhì)量的血漿外泌體顆粒。

圖1 提取的血漿外泌體的質(zhì)量評(píng)估Fig.1 Quality evaluation of the extracted plasma exosomes

2.2 血漿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

為繪制HCC血漿外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，本研究提取血漿中的外泌體，進(jìn)而采用鳥(niǎo)槍法策略和非數(shù)據(jù)依賴性采集方式進(jìn)行全蛋白質(zhì)組的高通量質(zhì)譜檢測(cè)。經(jīng)質(zhì)控過(guò)濾、數(shù)據(jù)歸一化及蛋白質(zhì)定性和定量分析（圖2A），共鑒定到1 434種蛋白質(zhì)。其中，20種蛋白質(zhì)為已知的外泌體表面的特征性標(biāo)志物，其表達(dá)豐度在所有鑒定的蛋白質(zhì)中排名靠前（圖2B）。在HCC組和HC組中分別鑒定到1 226和1 346種蛋白質(zhì)（圖2C），兩組之間有1 138種共有的蛋白質(zhì)。對(duì)鑒定到的1 434種蛋白質(zhì)與外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta和Vesiclepedia（圖2D）進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，有83.1%的蛋白質(zhì)是外泌體蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提示本研究富集到了高質(zhì)量的血漿外泌體。

圖2 血漿外泌體蛋白與外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta和Vesiclepedia的比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison of plasma exosomal proteins with the ExoCarta and Vesiclepedia databases

2.3 血漿外泌體中與HCC相關(guān)的候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物的鑒定

為鑒定HCC組和HC組的外泌體蛋白質(zhì)組是否存在差異，首先進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，血漿外泌體蛋白質(zhì)組可以將HCC組和HC組顯著分開(kāi)（圖3A），提示HCC發(fā)生時(shí)血漿外泌體發(fā)生了顯著變化。

為確保分析結(jié)果的可靠性，本研究只保留至少在2個(gè)樣本中被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)，并采用K最鄰近（K-nearest neighbor，KNN）法對(duì)缺失值進(jìn)行填充。最終，HCC組和HC組中分別保留了1 056和1 186種蛋白質(zhì)用于后續(xù)分析（圖3B）。進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)CD48是HCC組與HC組之間差異最為顯著的蛋白質(zhì)（Benjamin-Hochberg校正后，P=0.042，倍數(shù)變化為3.101，圖3C、3D），提示其可能具有作為HCC診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

圖3 基于發(fā)掘人群鑒定與HCC相關(guān)的外泌體蛋白Fig.3 Identification of HCC-associated proteins based on plasma exosomal proteomes in the discovery cohort

2.4 檢測(cè)血漿外泌體中CD48蛋白水平的ELISA方法的建立和評(píng)估

為進(jìn)一步評(píng)估血漿外泌體中的CD48蛋白作為候選HCC標(biāo)志物的診斷價(jià)值，首先招募獨(dú)立的HCC驗(yàn)證人群（表1），包括56例HCC患者、20例LC患者和48名HC。

為評(píng)估ELISA作為檢測(cè)血漿外泌體中CD48蛋白表達(dá)水平方法的可行性，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定其在外泌體上的定位。結(jié)果顯示，在沒(méi)有破外泌體膜的情況下，采用CD48抗體標(biāo)記的CD48蛋白在外泌體膜上有較高的豐度（圖4A），提示可通過(guò)ELISA方法檢測(cè)其表達(dá)水平。隨后，本研究建立了基于ELISA的CD48蛋白檢測(cè)方法，并對(duì)其檢測(cè)能力和適用范圍進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估（圖4B）。首先，分別采用外泌體特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物CD63的抗體作為捕獲抗體，CD48的抗體作為檢測(cè)抗體建立ELISA方法1（圖4B），分別評(píng)估其在同體積血漿提純的外泌體及同體積血漿中的檢測(cè)能力。結(jié)果顯示，ELISA方法1在血漿提純的外泌體中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值達(dá)到0.994（圖4C），在血漿中直接檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值也達(dá)到0.992（圖4D）。更重要的是，通過(guò)上述兩種檢測(cè)策略得到的結(jié)果呈顯著正相關(guān)（R=0.999，P＜0.001，圖4E），并且通過(guò)血漿提純的外泌體的濃度梯度對(duì)應(yīng)的吸光度（D）值（450 nm）與血漿樣本的濃度梯度對(duì)應(yīng)的的D值（450 nm）相差不超過(guò)0.02，表明ELISA方法1可直接從血漿樣本中檢測(cè)外泌體蛋白，而不必從預(yù)先提純的外泌體中檢測(cè)。

為排除血漿中游離的非外泌體中的CD48蛋白的干擾，將捕獲抗體換成CD48的抗體而建立ELISA方法2（圖4B）。結(jié)果顯示，此方法在CD48蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)較高的特異性（R2=0.989，圖4F）。隨后，在驗(yàn)證人群中隨機(jī)選取8例HCC患者和8名HC，同時(shí)采用ELISA方法1和方法2檢測(cè)血漿中CD48蛋白的表達(dá)水平。采用ELISA方法1檢測(cè)的結(jié)果顯示，血漿外泌體中CD48的表達(dá)水平在HCC組中顯著高于HC組（圖4G），而采用ELISA方法2檢測(cè)的結(jié)果顯示，血漿CD48的表達(dá)水平在HCC和HC樣本間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4H）。上述結(jié)果初步證實(shí)ELISA方法可以用于血漿外泌體蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)，提示血漿外泌體中的CD48蛋白可能作為潛在的HCC診斷標(biāo)志物。

圖4 自建ELISA方法檢測(cè)血漿外泌體中CD48蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Evaluation of the detection effect of self-built ELISA method

2.5 血漿外泌體中CD48蛋白用于HCC診斷價(jià)值的評(píng)估

為進(jìn)一步評(píng)估血漿外泌體中CD48蛋白的HCC診斷價(jià)值，采用建立的ELISA方法1在驗(yàn)證人群樣本中檢測(cè)血漿外泌體中CD48蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，采用ELISA方法平行檢測(cè)血漿AFP的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HCC組血漿外泌體中CD48蛋白的表達(dá)水平顯著高于LC組和HC組（P＜0.001，圖5A）；同時(shí)，血漿AFP在HCC組中的表達(dá)水平也顯著高于LC組和HC組（P＜0.001，圖5B）。

通過(guò)構(gòu)建ROC曲線，進(jìn)一步評(píng)估血漿外泌體中的CD48蛋白和血漿AFP鑒別HCC患者和對(duì)照個(gè)體（LC患者和HC）的能力。結(jié)果顯示，血漿外泌體中的CD48蛋白單獨(dú)鑒別HCC的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.886，最佳截?cái)嘀禐?.29 ng/mL，靈敏度和特異度分別為0.928和0.706；血漿AFP單獨(dú)鑒別HCC的AUC為0.796，最佳截?cái)嘀禐?.64 ng/mL，靈敏度和特異度分別為0.554和0.970。上述結(jié)果初步提示血漿外泌體中的CD48蛋白具有較高的靈敏度，而血漿AFP具有較高的特異度，兩者具有明顯的互補(bǔ)性。值得注意的是，這兩種蛋白質(zhì)建立的HCC預(yù)測(cè)Logistic回歸模型：Logit［P=HCC］=0.999×外泌體中CD48+0.067×AFP -7.385，從LC和HC中鑒別HCC患者的AUC達(dá)到0.970，靈敏度提升至0.929，特異度為0.971，均高于兩者單獨(dú)的診斷能力。以上結(jié)果提示血漿外泌體中的CD48蛋白可以作為HCC診斷的候選血漿標(biāo)志物，并且其與AFP聯(lián)合使用時(shí)可能具有更高的診斷價(jià)值 （表2，圖5C）。

圖5 血漿外泌體中CD48蛋白用于診斷HCC的潛在價(jià)值Fig.5 Performance of plasma exosomal CD48 for HCC diagnosis

表2 血漿AFP、血漿外泌體中的CD48單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC的診斷能力Tab.2 The performance of plasma AFP and plasma exosomal CD48 alone or their combination for HCC diagnosis

2.6 血漿外泌體中CD48表達(dá)水平與HCC臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

根據(jù)HCC血漿外泌體中CD48水平的中位數(shù)（7.15 ng/mL），將HCC患者分為高水平組（n=28）和低水平組（n=28）。χ2檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，HBV表面抗原陽(yáng)性的患者血漿外泌體中CD48的表達(dá)水平顯著高于陰性患者，其與年齡、性別、AFP、腫瘤大小和TNM分期無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（表3）。以上結(jié)果提示血漿外泌體CD48的表達(dá)水平可能與HBV相關(guān)HCC的早期發(fā)生相關(guān)，而與HCC的中晚期進(jìn)展無(wú)關(guān)。

表3 血漿外泌體CD48表達(dá)水平與HCC臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性Tab.3 Relationship between plasma exosomal CD48 levels and clinicopathological parameters of patients with HCC

3 討論

HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。研究［10］表明，慢性HBV或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、飲酒和黃曲霉毒素暴露等是誘發(fā)HCC的主要因素。目前臨床應(yīng)用的傳統(tǒng)血清標(biāo)志物檢測(cè)HCC的能力有限，缺乏高靈敏度的HCC早期診斷標(biāo)志物。因此，發(fā)現(xiàn)新的高靈敏度和特異度的HCC生物標(biāo)志物、提高HCC患者的生存率是臨床實(shí)踐中迫切需要解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)高通量血漿外泌體全蛋白質(zhì)組的檢測(cè)和篩選、血漿外泌體蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化、獨(dú)立隊(duì)列人群的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)等，初步證實(shí)血漿外泌體中的CD48蛋白有望作為HCC候選的診斷標(biāo)志物。

目前檢測(cè)血漿外泌體膜蛋白質(zhì)的常用方法有免疫印跡法、ELISA方法和單分子陣列法等。免疫印跡法具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好和相對(duì)較低的成本等優(yōu)點(diǎn)，但其靈敏度低、操作耗時(shí)長(zhǎng)［11］。ELISA方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、用時(shí)短、易于操作和相對(duì)較低的成本等優(yōu)點(diǎn)，然而，在需要進(jìn)行測(cè)量多種分析物時(shí)，同時(shí)運(yùn)行多種ELISA對(duì)時(shí)間、成本具有很高的要求［12］。盡管如此，ELISA方法仍是進(jìn)行血漿外泌體膜蛋白檢測(cè)的首選方法。單分子陣列法是一種基于磁珠的ELISA方法，抗原可以被固定在磁性微珠上的抗體所捕獲。此方法具有通量高、靈敏度高、重復(fù)性好、用時(shí)短和相對(duì)較低的成本等優(yōu)點(diǎn)，但是操作復(fù)雜、花費(fèi)高［13］。根據(jù)目前檢測(cè)血漿外泌體膜蛋白的常用方法的優(yōu)點(diǎn)，本研究建立了可直接在血漿中檢測(cè)外泌體CD48蛋白表達(dá)水平的ELISA方法。此方法重復(fù)性好、用時(shí)短、易于操作、成本低，同時(shí)無(wú)需進(jìn)行外泌體的純化，只需少量血漿樣本即可檢測(cè)。然而，基于ELISA方法檢測(cè)的局限性，現(xiàn)階段ELISA只能檢測(cè)外泌體的膜蛋白，而不能用于檢測(cè)外泌體內(nèi)的蛋白。

CD48基因位于1號(hào)染色體的1q21-23區(qū)域，包含4個(gè)外顯子，該基因編碼的CD48蛋白由243個(gè)氨基酸殘基組成［14］。研究［15］發(fā)現(xiàn)，前列腺分泌的細(xì)胞外囊泡表達(dá)高水平的CD48蛋白，并通過(guò)CD48蛋白阻斷自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞上的CD48受體CD244，從而干擾NK細(xì)胞功能。此外，前列腺癌患者血漿中的細(xì)胞外囊泡被證明是其診斷標(biāo)志物［16］。也有研究［17］表明，在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD48蛋白可能是肉瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物。以上研究提示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體CD48蛋白，可能具有診斷多種腫瘤的潛在價(jià)值。

綜上所述，血漿外泌體中的CD48蛋白是一種新的HCC候選診斷標(biāo)志物。本研究建立的ELISA方法可用于直接檢測(cè)血漿樣本中外泌體的CD48蛋白，且具有血漿樣本用量少、成本低和操作簡(jiǎn)易等優(yōu)勢(shì)。未來(lái)尚需招募更大規(guī)模的HCC患者多中心臨床隊(duì)列，以進(jìn)一步驗(yàn)證血漿外泌體中CD48蛋白的潛在診斷價(jià)值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。