康茗貽，郜 意，胥 婧，康 玉，徐叢劍,

1.復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011；

2.上海市女性生殖內(nèi)分泌相關疾病重點實驗室，上海 200011；

3.復旦大學上海醫(yī)學院婦產(chǎn)科學系，上海 200032

卵巢高鈣血癥型小細胞癌（small cell carcinoma of the ovary,hypercalcemic type，SCCOHT）是一種臨床上極為罕見的原發(fā)性未分化卵巢癌類型，腫瘤生物學行為具有高度惡性，組織構成及其起源迄今仍未完全確定［1-2］。SCCOHT好發(fā)于年輕女性，平均年齡約24歲，約62%的患者以惡心、嘔吐、不明原因的高鈣血癥作為首診癥狀。目前對SCCOHT主要采取手術、化療、放療相結合的綜合治療方案，因其對放療和化療敏感性差，所以預后極差，且易復發(fā)，1年存活率僅為50%，5年存活率＜10%，約74.5%的患者會復發(fā)，且其中位復發(fā)或進展時間僅為6.5個月［3］。SCCOHT是一種少見的單基因突變腫瘤，約90%以上的患者都存在SMARCA4基因的胚系或體系突變，這也被視為SCCOHT的主要發(fā)病特征［4］。SCCOHT中SMARCA4基因突變會導致其編碼的BRG1蛋白表達缺失，這也常作為其診斷的重要指標。

腫瘤微環(huán)境包括多種細胞類型，這些細胞類型的存在共同導致腫瘤生長和轉移，從而引起發(fā)病。腫瘤微環(huán)境中的每個細胞都具有獨特的基因組、表觀基因組、轉錄組和蛋白質組。即使是基因相同的細胞也會在驅動、調節(jié)、轉錄和翻譯的機制上有所差異，從而導致不同的基因表達。既往研究［5］發(fā)現(xiàn)，SCCOHT雖然作為一種單基因突變腫瘤，具備較低的腫瘤突變負荷，但在其腫瘤微環(huán)境中，依然存在增加的腫瘤浸潤淋巴細胞和高表達的程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）。然而對于SCCOHT的腫瘤微環(huán)境內(nèi)細胞類型的構成仍缺乏足夠的認識。

SCCOHT的靶向藥物主要是利用SMARCA4功能缺失引起的已知合成致死作用，以及通過無偏遺傳篩選得到的靶標，包括EZH2抑制劑［6］、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）抑制劑［7］、細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/6）抑制劑［8］等。目前，SCCOHT靶向治療的臨床效果有限，還需要更多的研究來探究SCCOHT的潛在藥物靶標。單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）以其極高的分辨率無疑成為探索SCCOHT腫瘤微環(huán)境及潛在藥物靶標的有力工具。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

收集2020年10月—2021年6月就診于復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、經(jīng)病理學檢查診斷為SCCOHT的盆腔復發(fā)病灶腫瘤組織，同時收集另外3例SCCOHT患者的手術切除組織切片及3例由于良性病變進行卵巢切除手術的組織切片。本研究經(jīng)復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會審查通過，并已取得患者知情同意。

1.2 實驗細胞

人SCCOHT細胞系COV434［9］購自美國Sigma公司，并進行短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）驗證其SMARCA4突變信息；人卵巢正常上皮細胞IOSE80、高級別漿液性卵巢癌細胞系OVCAR3及OVCAR8均為本課題組前期購買、鑒定和保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 數(shù)據(jù)處理

使用R 語言Seurat 包篩選基因數(shù)量為200～ 7 500、線粒體基因比例小于20%、血紅蛋白基因比例小于5%的細胞，整合各樣本數(shù)據(jù)并使用harmony矯正批次效應。

1.3.2 降維聚類與細胞注釋

使用RunPCA函數(shù)及RunTSNE函數(shù)進行細胞降維聚類，查看標記基因的表達并進行細胞 注釋。

1.3.3 軌跡分析

利用Monocle包分析調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）發(fā)育軌跡。使用newCellDataSet函數(shù)創(chuàng)建數(shù)據(jù)集進行后續(xù)分析，隨即設置max_components為2和“DDRTree”進行降維，并使用“orderCells”對細胞進行排序，獲得細胞發(fā)育軌跡。

1.3.4 scCancer算法

分析每個細胞基因表達值與數(shù)據(jù)庫提供的參考值相比的基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）信息，并根據(jù)整體基因拷貝數(shù)變化的情況對細胞進行惡性打分（malignScore）。scCancer參考R包算法inferCNV來估計初始CNV分布圖。然后，通過滑動窗口來獲得細胞的CNV值，并將惡性評分定義為它們的平方的平均值。

1.3.5 免疫組織化學染色

烤片；脫蠟；置于3%過氧化氫溶液中10 min；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）洗3次，每次5 min；抗原修復；轉移至濕盒，用免疫組織化學筆圈出組織邊緣；3%過氧化氫溶液滴于切片上，37 ℃溫育 25 min；一抗溫育：濕盒中4 ℃過夜；自然復溫 1 h；二抗溫育，37 ℃溫育1 h；加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液；蘇木精復染，脫水；置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各5 min；中性樹膠1～ 2滴封片。

1.3.6 蛋白質印跡法（Western blot）

蛋白樣品制備；蛋白定量；配膠；電泳：電泳程序先設置為60 V，待樣本跑到下層膠（15～ 30 min），將程序調整為120 V，約 70 min；轉膜：轉膜程序設置為300 mA，然后根據(jù)所需要的蛋白分子質量調整轉膜的時間；封閉：用含有吐溫-20三乙醇胺緩沖鹽溶液（trisbuffered saline Tween，TBST）配制5%的脫脂牛奶，將膜浸泡其中，室溫搖床上緩慢搖45～ 60 min；一抗溫育：將封閉結束的膜按照不同相對分子質量大小進行裁剪，置于相應的一抗中，在搖床上4 ℃溫育過夜；二抗溫育：置于5%脫脂牛奶配置的二抗中，室溫60 min；顯色。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

提取RNA樣本后按照日本Takara公司反轉錄試劑盒中的體系配體比配制反應體系，反應時間的設定條件一般均為37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。以反轉錄得到的cDNA為模板進行，實驗過程中所有樣品和試劑均置于冰上保持低溫環(huán)境，并且注意避光。將cDNA稀釋3～ 5倍后進行上樣。反應程序為95 ℃ 30 s；60 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；40個循環(huán)，并添加溶解曲線（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s）。

1.4 生物信息學分析

1.4.1 GO分析

使用Fisher算法對樣品間不同基因組完成轉錄基因的分子功能（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC）、生物學過程（biological process，BP）的富集解析。根據(jù)上述分析結果，運用超幾何檢驗，找出差異表達基因明顯富集的GO條目。

1.4.2 KEGG分析

使用KEGG數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)結合KEGG注釋結果對差異基因開展通道分析，并用超幾何分布試驗的方法分析各個通道中差異基因富集的顯著性。

2 結果

2.1 依據(jù)Fine數(shù)據(jù)庫進行細胞類型注釋，SCCOHT中存在4種細胞亞群和12個細胞亞簇

利用marker基因和單細胞測序細胞類型注釋軟件SingleR［10］相結合，注釋細胞類型。SingleR軟件以RNAseq的數(shù)據(jù)資料為參照系，選取高變異的基因，經(jīng)過反復比較和循環(huán)運算，最后得出一種預測細胞類型的注解結果（圖1）。

圖1 細胞注釋后依據(jù)cluster的TSNE可視化結果Fig.1 Visualization results of TSNE based on cluster after cell annotation

參照Main數(shù)據(jù)庫進行比對與注釋提供的信息比較簡略，除C10細胞亞群被定義為巨噬細胞以外，其余所有細胞亞群被定義為神經(jīng)細胞。而與Fine數(shù)據(jù)庫進行對比注釋提供的信息相對豐富。其中，C1、C3、C4、C6、C7細胞亞群被定義為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），C0、C2、C5、C8、C11細胞亞群被定義為神經(jīng)施萬細胞，C9被定義為神經(jīng)上皮細胞，C10被定義為巨噬細胞。雖然在兩種數(shù)據(jù)庫的比對與注釋之下，均未定義出經(jīng)典的卵巢腫瘤細胞或腫瘤上皮細胞，但Fine數(shù)據(jù)庫可以提供更加豐富的信息與結果，因此采用Fine數(shù)據(jù)庫的比對結果進行后續(xù)分析。

對相同細胞亞群進行合并，發(fā)現(xiàn)iPSC細胞亞群占比超過50%，在本次獲取的樣本中占比最多，神經(jīng)施萬細胞占比僅次于iPSC細胞亞群，神經(jīng)上皮細胞占比較少，而巨噬細胞數(shù)量最少。

2.2 SCCOHT腫瘤微環(huán)境中細胞亞群的惡性程 度

在細胞的生長、分化過程中，各個細胞狀態(tài)是一個不斷發(fā)生變化的過程，腫瘤內(nèi)不同細胞所處的生長分化狀態(tài)也有所不同，擬時序（pseudotime）分析就是通過特殊計算了解所有基因表達模式，并將每個細胞安排在自己的生長和分化軌跡上。為進一步了解細胞亞群之間的分化變化情況，我們利用Monocle軟件進行pseudotime分析。

在進行pseudotime分析后，發(fā)現(xiàn)5個關鍵的細胞分化時間節(jié)點（圖2）。在細胞分化的時間軌跡上將細胞亞群所處的分化階段進行定位與分析，發(fā)現(xiàn)各細胞簇所處的分化時間有所不同。

圖2 細胞分化時間與亞群細胞分化軌跡展示Fig.2 Display of cell differentiation time and subpopulation cell differentiation track

為進一步明確樣本中惡性程度高的細胞亞群，應用scCancer分析明確每一個細胞和細胞亞群的惡性程度得分［11］。通過與數(shù)據(jù)庫參考的惡性程度分值進行對比，發(fā)現(xiàn)本樣本中所有細胞組分的惡性程度評分均高于參考值，即與參考庫相比，本樣本所含細胞均為惡性（圖3）。

圖3 惡性程度分值及惡性程度分類的TSNE可視化結果Fig.3 TSNE visualization results of malignant degree score and classification

2.3 iPSC細胞亞群顯著上調基因富集于細胞周期調控通路

根據(jù)之前的實驗結果，對于SCCOHT這種罕見疾病，僅依靠scRNA-seq暫時無法明確其內(nèi)部關鍵的細胞亞群。本研究發(fā)現(xiàn)，有超過50%細胞被定義為iPSC，這一亞群中存在最多的分化時間較晚、惡性程度較高的細胞亞簇。既往文 獻［12-13］報道，干細胞主要分為3種基本類型，包括胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）、腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）和iPSC。這3種主要的多能干細胞類型都具有同樣的干性、組織再生功能和機體自我更新能力等獨特性質［12］。與其他干細胞不同，ESC在正常生理條件下幾乎不存在致瘤性，而CSC和iPSC都具備一定的致瘤特性［12］。因此，iPSC很可能是影響SCCOHT復發(fā)、進展等惡性行為的關鍵細胞亞群。

對iPSC與非iPSC進行差異基因功能富集GO和KEGG分析，結果顯示，在多能干細胞細胞亞群中顯著上調的基因功能主要富集于細胞周期、細胞分裂等相關功能調控通路。其中，PLK1基因顯著上調，且涉及最多的信號轉導通路（圖4）。

圖4 對iPSC與非iPSC進行差異基因功能富集分析Fig.4 Differential gene function enrichment analysis was conducted for iPSC and non iPSC

2.4 SMARCA4和PLK1蛋白在SCCOHT細胞系、人卵巢正常上皮細胞系及高級別漿液性卵巢癌細胞系中的表達水平

為明確SMARCA4和PLK1蛋白在SCCOHT細胞系中的表達水平，檢測了SMARCA4和PLK1蛋白在SCCOHT細胞系COV434、人卵巢正常上皮細胞系IOSE80和高級別漿液性卵巢癌細胞系OVCAR8中的表達水平。結果顯示，在COV434細胞中，SMARCA4蛋白不表達，PLK1表達水平明顯升高，并且顯著高于IOSE80（P=0.001）及OVCAR8（P=0.001）。而在OVCAR8細胞中，SMARCA4和PLK1蛋白有表達，SMARCA4蛋白表達水平高于IOSE80細胞（P=0.001）和COV434（P=0.001），PLK1蛋白表達水平低于IOSE80細胞（P=0.001）和COV434細胞（P=0.001，圖 5）。

圖5 SMARCA4和PLK1蛋白在SCCOHT細胞系COV434、卵巢正常上皮細胞系IOSE80 和高級別漿液性卵巢癌細胞系OVCAR8中的表達情況Fig.5 Expression of SMARCA4 and PLK1 proteins in SCCOHT cell line COV434,normal ovarian epithelial cell line IOSE80 and highgrade serous ovarian cancer cell line OVCAR8

2.5 SMARCA4和PLK1 mRNA在SCCOHT細胞系、人卵巢正常上皮細胞系及高級別漿液性癌細胞系中的轉錄水平

為進一步明確SMARCA4和PLK1 mRNA在SCCOHT細胞系中的轉錄水平，檢測SMARCA4和PLK1 mRNA在SCCOHT細胞系COV434、人卵巢正常上皮細胞系IOSE80和高級別漿液性癌細胞系OVCAR8中的轉錄水平。結果顯示，在COV434細胞中，SMARCA4 mRNA水平顯著低于IOSE80細胞（P=0.001）和OVCAR8細胞（P=0.001），PLK1 mRNA水平顯著高于IOSE80細胞（P=0.007）及OVCAR8細胞（P=0.002，圖6）。

2.6 PLK1在SCCOHT腫瘤組織中的表達水平

進一步通過免疫組織化學染色比較SCCOHT患者腫瘤組織中及因良性病變行手術治療患者的卵巢組織中PLK1的表達。結果顯示，正常卵巢組織中PLK1表達陽性率較低，SCCOHT中PLK1都有不同程度的表達，說明PLK1不僅在SCCOHT細胞系中高表達，在SCCOHT腫瘤組織中也呈高表達，提示PLK1高表達可能是SCCOHT中的一種常見事件（圖7）。

圖7 PLK1蛋白在SCCOHT組織切片中的表達情況Fig.7 Expression of PLK1 protein in SCCOHT tissue sections

3 討論

本研究分別利用Single R［10］及Marker基因聯(lián)合分析，參考Main數(shù)據(jù)庫和Fine數(shù)據(jù)庫對細胞亞群進行注釋。Main數(shù)據(jù)庫提供的信息相對簡略，F(xiàn)ine數(shù)據(jù)庫提供的信息相對豐富。在Main數(shù)據(jù)庫的對比注釋結果中，除C10細胞亞群被定義為巨噬細胞以外，其余所有細胞亞群被定義為神經(jīng)細胞。而與Fine數(shù)據(jù)庫進行對比注釋后，C1、C3、C4、C6、C7細胞亞群被定義為iPSC，C0、C2、C5、C8、C11細胞亞群被定義為神經(jīng)施萬細胞，C9被定義為神經(jīng)上皮細胞，C10被定義為巨噬 細胞。

對比兩種數(shù)據(jù)庫的注釋結果，發(fā)現(xiàn)在兩種數(shù)據(jù)庫的參照比對下均未定義出經(jīng)典的卵巢腫瘤細胞或卵巢上皮細胞。分析原因，一方面可能是由于本例卵巢腫瘤組織取自盆腔復發(fā)病灶組織，并不是來自于卵巢；另一方面可能是由于SCCOHT發(fā)病率低，目前尚未有研究描繪出SCCOHT的單細胞轉錄組圖譜；更重要的是，SCCOHT的基因組和轉錄組特點為SMARCA4基因的失活突變［14］，進而導致其在mRNA水平無法被檢測出，而scRNA-seq是通過轉錄組中獲取高表達的基因來進行細胞分類，因此無法直接定義出SCCOHT細胞亞群。

雖然兩個數(shù)據(jù)庫作為參考均未定義出經(jīng)典的卵巢腫瘤細胞，但Fine數(shù)據(jù)庫比Main數(shù)據(jù)庫可以提供更加詳細的注釋信息，因此，本研究采用Fine數(shù)據(jù)庫的注釋結果進行后續(xù)分析。在Fine數(shù)據(jù)庫的注釋結果中，C0、C2、C5、C8、C11細胞簇被定義為神經(jīng)施萬細胞，C9被定義為神經(jīng)上皮細胞，這與SCCOHT的神經(jīng)-內(nèi)分泌細胞起源學說相符［15］；C10被定義為巨噬細胞，但數(shù)量極少，驗證了SCCOHT的免疫微環(huán)境具有較少的免疫細胞浸潤［16］；C1、C3、C4、C6、C7細胞簇被定義為iPSC，占據(jù)超過樣本的50%細胞量，且具有干性［13］，可能是SCCOHT中的關鍵細胞亞群。

眾所周知，干細胞主要包括ESC、CSC和iPSC［12］。CSC、iPSC和ESC等也都同樣具有干性和細胞自我更新修復等獨特能力。在正常生理狀況下，ESC不具備致瘤性，而CSC和iPSC卻能在特定的環(huán)境下導致腫瘤發(fā)生、進展，也可能導致臨床治療腫瘤過程中不斷出現(xiàn)的藥物耐藥、復發(fā)和轉移等問題［17］。與CSC和ESC不同，iPSC是由人工在體外誘導得到的，目的是將此項技術應用于臨床再生醫(yī)學領域。臨床再生醫(yī)學在展現(xiàn)出廣泛的技術應用和產(chǎn)業(yè)潛力的同時，也對其應用的安全性提出了更高的要求。

本研究將12個細胞簇中相同細胞亞群合并后進行TSNE可視化分析發(fā)現(xiàn)，iPSC細胞亞群組成的細胞數(shù)量多，iPSC具有多能干性和致瘤性，因此，我們認為iPSC可能是SCCOHT中獨特的細胞亞群，與SCCOHT高度惡性、易復發(fā)、易進展 相關。

本研究對iPSC細胞亞群與niPSs細胞亞群進行差異表達基因富集分析，結果顯示，在多能干細胞細胞亞群中顯著上調的基因功能主要富集于細胞周期調控通路。其中，PLK1基因顯著上調，且涉及最多的信號轉導通路。

PLK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于人類真核細胞組織中，結構高度保守［18］。1988年POLO基因首次于果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，隨后有研究報道了PLK1基因的功能［18］。在細胞有絲分裂進程中，PLK1主要在G2/M期轉化、姐妹染色單體分離、中心體成熟及有絲分裂后期細胞質分裂等4個方面參與細胞有絲分裂調控，并且參與控制有絲分裂過程的正常啟動和退出［19］。除參加正常的細胞有絲分裂調控以外，還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，盡管PLK1作為癌基因的證據(jù)仍然不足，但越來越多的證據(jù)表明PLK1參與腫瘤發(fā)生。

在SCCOHT細胞系、SCCOHT患者的腫瘤組織中均能檢測到PLK1蛋白表達的升高，在SCCOHT細胞系中也能檢測到PLK1 mRNA水平的升高，說明PLK1的表達升高可能是SCCOHT中的一種常見事件，PLK1可能在SCCOHT的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，并且也預示著PLK1可能成為高鈣血癥型小細胞卵巢癌治療的潛在靶點。

本研究首次將scRNA-seq應用于SCCOHT這一罕見的婦科腫瘤領域，為以SCCOHT為代表的罕見疾病的基礎研究和臨床治療方案制訂提供了新思路。通過scRNA-seq，初步描繪了SCCOHT獨特的單細胞圖譜，鑒定出SCCOHT中存在iPSC這一關鍵細胞亞群，并尋找到在關鍵細胞亞群中顯著上調的PLK1基因，進一步在生物信息學、細胞學、臨床組織樣本中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)PLK1可能成為治療SCCOHT的潛在靶點。

本研究是通過對1例SCCOHT病例的盆腔復發(fā)病灶組織樣本進行scRNA-seq開展的，尚缺乏在大規(guī)模的臨床病例中進行單細胞水平的驗證和對照。同時，復發(fā)病灶與原發(fā)病灶之間的單細胞圖譜或許存在一定差異，但由于SCCOHT的確診往往依賴于術后病理學檢查、基因檢測報告及家族史等的綜合診斷，而單細胞測序要求組織保持細胞活性，因此對于原發(fā)病灶的獲取并行scRNA-seq較為困難。在細胞注釋過程中，未注釋出上皮細胞或腫瘤細胞，這可能與SCCOHT罕見性有關，關于惡性細胞的鑒定與注釋仍需進一步分析。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。