王彩云，侯俊，周茂嫦，李恒謙，成忠均，王永，張翔宇

（1.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700；2.大方縣扶貧開發(fā)辦公室，貴州 畢節(jié) 551700）

天麻（Gastrodia elataBl.）為蘭科天麻屬多年生草本植物，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，含對羥基苯甲醇、多糖、腺苷、天麻素、巴利森苷等多種活性成分［1-5］，具有增強機體免疫力、鎮(zhèn)靜安神、抗癲癇、健腦增智、治療老年性癡呆癥、調節(jié)腸道菌群、延緩衰老、抗氧化、抗炎、降壓、抗抑郁、調節(jié)心腦血管、神經保護等功能［6-13］。全世界有30多種天麻屬植物，中國確認的有13種，分別為天麻、疣天麻（Gastrodia tuberculata.F.Y.Liu et S.C.Chen）、細天麻（Gastrodia gracilisBI.）、原天麻（Gastrodia angustaS.Chow S.C.Chen）、夏天麻（Gastrodia flabilabellaS.S.Ying.）、南天麻（Gastrodia JavanicaBI.Lindi）、冬天麻（Gastrodia hiemalisT.P.Lin.）、勐海天麻（Gastrodia menghaiensisZ.H.Tsi & S.C.Chen.）、秋天麻（Gastrodia autumnalisT.P.Lin.）、春天麻（Gastrodia fontinalisT.P.Lin.）、八 代 天 麻（Gastrodia confusaHonda &Tuyama.）、無喙天麻（Gastrodia appendiculataC.S.Leou & N.J.Chung.）、北插天天麻（Gastrodia peichatienianaS.S.Ying.），其中中國主要分布的、載入中國藥典的是天麻，按照塊莖形狀、含水量的不同、花及莖桿顏色又分為黃天麻（Gastrodia elataBI.f.flavida S.Chow）、烏天麻（Gastrodia elataBI.f.glauca S.Chow）、紅天麻（Gastrodia elataBI.F.elata）、綠天麻（Gastrodia elataBI.F.viridis Mak.）、毛天麻（Gastrodia elataBI.F.Pilifera Tuyama）和松天麻（Gastrodia elataBI.F.alba S.Chow）6個變型［14］。隨著天麻被列入保健食品名錄，其需求量逐漸增大，野生天麻供不應求，人工馴化栽培雖能緩解部分市場壓力，但長期跨地區(qū)引種、無性繁殖、有性雜交育種，造成市場上種質資源混亂，給天麻產業(yè)發(fā)展帶來巨大的潛在危機。不同天麻塊莖在表觀性狀上差異不大，而天麻素、天麻苷元等有效成分含量差異卻極大，且混偽品泛濫，導致藥材品質良莠不齊，給天麻生產、臨床用藥、產品開發(fā)造成極大的困難。因此，亟需研究該藥材的遺傳多樣性，為天麻產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科技支撐。

作為藥食兩用植物，天麻一直是研究熱點，目前的研究主要集中于生物學特性、化學成分、藥理作用和臨床應用等多個方面［15-19］。在天麻的遺傳多樣性研究中，傳統(tǒng)的研究主要基于形態(tài)學標記，20世紀90年代后主要基于DNA分子標記，近幾年主要基于測序技術研究其親緣關系、遺傳進化以及資源分類鑒定等［20-23］。本研究從表型性狀、細胞學水平、生化標記以及分子標記4個方面對天麻遺傳多樣性研究進展進行綜述，以期為天麻的資源保護、深入研究以及開發(fā)利用提供理論依據。

1 遺傳多樣性研究的意義

了解天麻的遺傳多樣性有助于評估其資源的瀕危狀況，以便采取必要手段保護天麻資源，最終實現(xiàn)天麻產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。遺傳多樣性研究的方法很多，如較傳統(tǒng)的形態(tài)學分析、細胞學分析以及生化標記等，目前使用較為普遍的方法為DNA分子標記技術，其中應用于天麻遺傳多樣性分析的已有近10種［14，24］。天麻的遺傳多樣性較豐富，為天麻種質資源的改良以及保護奠定了堅實的基礎。

開展植物群體遺傳結構及影響因子的研究對植物資源的遺傳改良、保護、開發(fā)利用有重要意義［25，26］。在中國，天麻為廣域分布藥材，但受道地藥材理念的影響，以致野生天麻價格遠高于栽培天麻，致使野生天麻資源遭到過度采挖，最終導致其淪為瀕危物種，這種狀況在一定程度上影響了天麻的遺傳多樣性。目前有關天麻遺傳多樣性研究的報道相對較少，尤其是細胞學標記以及生化標記方面，開展天麻的遺傳多樣性研究，有利于優(yōu)良天麻資源的選育，更有利于提高天麻產品的穩(wěn)定性。

2 遺傳多樣性研究方法

生物進化的基礎是遺傳多樣性，任意物種都有其獨特的基因庫或遺傳組織形式。遺傳多樣性有廣義與狹義之分，前者是指地球上生物體所攜帶的各種遺傳信息之和，后者指的是一個種群內不同個體之間或者種內不同種群之間的遺傳變異總和［27］。遺傳多樣性可以從不同的層次來表現(xiàn)，通常表現(xiàn)在表型性狀水平、細胞學水平、生化水平及分子水平。

2.1 表型性狀多樣性分析

天麻表型性狀多樣性分析是基于天麻形態(tài)學標記來完成的，即根據表型上的差異，如天麻塊莖形狀、長度、寬度、長寬比、箭芽顏色、肚臍眼大小、花色、莖桿顏色、點狀橫紋環(huán)數等性狀的不同來反映其遺傳多樣性，這些表型性狀大多肉眼可見，無需太高的技術含量，對操作者要求不高，也無需高端儀器設備，節(jié)省資金，不僅能標記數量性狀而且還可以標記質量性狀，因此，形態(tài)學標記作為傳統(tǒng)的遺傳多樣性研究方法在育種及植物分類工作中起到重要作用。

目前，很多學者將形態(tài)學標記應用于天麻的資源鑒定以及育種等工作中。如王秋穎等［28］基于形態(tài)學標記，采用雜交育種方法選育出2個適宜大面積推廣應用的高產天麻種。王麗等［29］研究了昭通烏天麻塊莖的農藝性狀，發(fā)現(xiàn)不同產區(qū)烏天麻變異較大的性狀為肚臍眼直徑、環(huán)間距、塊莖鮮重，點狀橫環(huán)紋環(huán)數、塊莖長、寬、厚以及長寬比為較穩(wěn)定性狀；經統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)高產烏天麻的最突出農藝性狀指標為塊莖長、寬、厚，生產上可作為高產品種選育的參考指標；道地藥材質量控制的性狀指標為點狀橫紋環(huán)數和塊莖長寬比。李振斌等［30］采取生藥學常規(guī)方法，對比觀察了紅天麻、烏天麻、綠天麻的原植物形態(tài)、顯微特征、藥材性狀，同時觀察了花粉塊的掃描電鏡特征，找出了其主要鑒別特征。

2.2 細胞水平多樣性分析

基于細胞學標記來研究的細胞水平遺傳多樣性，即根據細胞染色體核型和帶型差異分析染色體的多樣性，進而分析物種的遺傳多樣性。細胞學標記在天麻遺傳多樣性研究中的應用較少，主要集中于研究天麻的退化、消化、染色體變異等方面。張維經等［31］研究了天麻消化細胞的消化行為，發(fā)現(xiàn)天麻消化細胞消化能力的衰退與天麻無性繁殖的增殖率下降一致，即隨著種植年限的延長，天麻產量逐漸下降，同時天麻皮層細胞中的蜜環(huán)菌［Armillaria mellea（Vahl）P.Kumm.］菌絲侵入消化細胞后釋放出大量細胞質，導致消化細胞的核畸形化并出現(xiàn)多核仁，體積增大。梁漢興［32］1984年以花粉小孢子為試驗材料研究原天麻單倍體的染色體數目，王德信［33］2010年又以同樣的材料，研究減數分裂過程中的細胞學特性，提出天麻單倍體的染色體數目為18，但未能很好地呈現(xiàn)天麻的染色體特征，染色體倍數也未能鑒定出。

雖然細胞學標記不易受外界環(huán)境因素的影響，但仍存在許多不足，如培育材料需花費較長時間，染色體的制片和觀察要求操作者具備一定的理論基礎及實踐經驗，通過細胞學標記能獲得的標記數量也不多，尤其是同一物種的不同個體之間染色體特征差異不大。因此，在開展天麻的遺傳多樣性研究時，不能僅依賴于細胞學研究結果來判斷。

2.3 生化水平多樣性分析

生化水平多樣性分析主要基于蛋白質多樣性分析，即從貯藏蛋白、同工酶等變異來研究作物種內、種間的遺傳多樣性。在天麻的生化水平多樣性研究中大部分基于同工酶、等位酶分析，即在蛋白質水平，依靠酶分子的構象、帶電荷數、大小、在電場中的遷移速率以及形成譜帶數目等不同，直接鑒定天麻不同品種間的遺傳差異［34］。因其具有受外界環(huán)境影響較小、試驗技術要求不高、成本低、結果易于比較、準確性高等優(yōu)點，在植物遺傳多樣性研究中被廣泛應用。

2.3.1 同工酶分析近年來，同工酶分析被大量應用于天麻親緣關系分析、種質資源鑒定，種類、種間遺傳多樣性分析等方面。張躍進等［35］提出不同天麻種質之間的過氧化物酶同工酶譜有著很高的多態(tài)性，按照1977年Garva等提出的“同工酶條帶越多的品系越進化”的理論，卵果天麻較原始，其同工酶譜條帶最少；紅桿天麻的條帶最多，最為進化，其結果與季景玉［36］利用同工酶研究秦巴山區(qū)天麻種質資源的遺傳多樣性時得出的結果一致。陳文強等［37］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳研究了綠天麻、紅天麻、烏天麻的過氧化物酶同工酶的活性差異，發(fā)現(xiàn)不同變型天麻的酶活性不同，表現(xiàn)為紅天麻和烏天麻的酶譜條帶數相同，均為7條，相似度指數為0.86，暗示他們之間的親緣關系較近；綠天麻的酶譜條數為5條，與烏天麻的相似度指數為0.71，暗示其親緣關系相對較遠。潘瑞樂等［38］研究了不同發(fā)育階段天麻的可溶性蛋白和過氧化物酶同工酶的差異性，發(fā)現(xiàn)酶譜特征與生長發(fā)育階段相關，具體表現(xiàn)：白麻和箭麻未抽苔階段酶帶數少、活性低；抽苔開花階段酶帶數多、活性高。姜玲等［39］研究了紅天麻、烏天麻及其雜交種的過氧化物酶同工酶譜帶差異，發(fā)現(xiàn)紅天麻、烏天麻正交所得的雜交種譜帶表現(xiàn)出明顯的親本互補關系。2.3.2等位酶分析將等位酶分析應用于天麻遺傳多樣性研究的報道較少。目前僅發(fā)現(xiàn)李作洲等［40］利用超薄平板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳研究湖北省西部4種變型天麻的等位酶遺傳變異，結果在6個酶系共發(fā)現(xiàn)17個清晰位點和37個等位基因，其中多肽位點有11個，位點最大等位基因數為4，表現(xiàn)出變型特異性的是位點Acp-4和Prx-2的等位基因；遺傳多樣性研究結果顯示，不同變型天麻的遺傳多樣性較低，平均預期雜合度He=0.146，每位點平均等位基因數A=1.7，平均多態(tài)位點比率P=42.2%，其中烏天麻遺傳多樣性最高，藥天麻最低；而在物種水平上遺傳多樣性較高（P=56.3%，A=2.1，He=0.221）。

2.4 分子水平多樣性分析

分子水平多樣性研究是基于DNA堿基序列差異分析作物的遺傳多樣性。相比細胞學、形態(tài)學、生化標記，DNA分子標記微量分析特異性強、準確性高、直接快速、多態(tài)性高、信息量大，不受生長發(fā)育階段以及組織、環(huán)境條件的影響，不存在上位性效應，是目前分析作物遺傳多樣性的最佳選擇。近年來，該技術被普遍應用于天麻的遺傳多樣性分析中，應用較多的主要為RAPD、SSR、AFLP、ISSR以及ITS序列分析技術。

2.4.1 隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）RAPD標記技術于1990年由John G.K.Williams等建立，基于PCR，以人工合成的隨機短核苷酸序列（一般為10個堿基）為引物對所研究的基因組DNA進行擴增，判斷擴增片段的多樣性。該方法所需引物沒有種屬限制，無需專門設計，即可以在DNA序列信息未知的情況下，對物種基因組進行分析，具有操作簡單、檢測快速，不受環(huán)境狀況、數量遺傳性狀、發(fā)育階段的影響等優(yōu)勢，即便是親緣關系非常相近的個體間的遺傳差異也能有效區(qū)分，在植物分類及遺傳多樣性研究中具有很明顯的優(yōu)越性，目前被廣泛用于天麻遺傳多樣性研究中，但該技術擴增得到的片段重復性和穩(wěn)定性較差，特異性不強。

陶鈞等［41］優(yōu)化了RAPD擴增條件和方法，獲得了天麻基因組DNA指紋圖譜。鄒佳寧等［42］利用RAPD技術分析貴州同一產地栽培、野生天麻的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)栽培與野生天麻之間遺傳變異明顯，而且生長環(huán)境和地理分布是造成天麻豐富遺傳多態(tài)性的重要因素。王德信［43］建立了黃、烏、綠3種變型天麻的RAPD分析圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻變異程度較大，多態(tài)性變異率高達65.1%，其中遺傳多樣性最豐富、變異最為復雜的是烏天麻。趙熙等［44］采用RAPD技術研究天麻的親緣關系，發(fā)現(xiàn)親緣關系最近的是黃天麻和烏天麻，與綠天麻的親緣關系較遠，該結果與王德信［43］的研究結果存在一定差異。李相陵［45］利用RAPD技術研究貴州省不同產區(qū)不同變型天麻栽培品種F1代的遺傳多樣性，共獲得138條譜帶，擴增位點分子為200?2 000 bp，其中92條為多態(tài)性條帶，多態(tài)位點百分率為66.92%?85.90%，暗示不同產區(qū)不同變型天麻之間具有較大的遺傳差異。陶鈞［46］采取RAPD技術開展天麻基因組DNA的多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的多態(tài)性，同時發(fā)現(xiàn)天麻遺傳距離系數與其產地、莖桿顏色之間存在明顯的相關性，遺傳距離最遠的為綠桿天麻與紅桿天麻。

2.4.2 擴增片段長度多態(tài)性（Amplifid fragment length polymorphism，AFLP）AFLP標 記 是 基 于RFLP和PCR技術，通過限制性內切酶將基因組DNA酶切成分子大小不等的片段，然后進行擴增、電泳，根據擴增片段長度的不同來分析DNA多態(tài)性的一種DNA指紋分析技術。不同于其他分子標記技術，AFLP技術用PCR擴增取代Southern雜交來得到限制性片段，不僅分辨率、靈敏度高，檢測到的基因位點數量多，重復性好，多態(tài)性強，穩(wěn)定性高；選用不同的基因型DNA以及引物組合，獲得的酶切位點不同，因此出現(xiàn)擴增片段的長度多態(tài)性，而且還能檢測到親緣關系非常近的品種間的DNA差異，被稱為一種高效精準檢測種間種內遺傳差異的技術，但該方法要求內切酶質量和DNA純度很高，價格昂貴。該技術被廣泛應用于分子生物學、生物遺傳、育種等研究領域，目前是國際上構建DNA指紋圖譜的一種新方法。

謝淵等［47，48］構建了11份不同來源天麻資源的AFLP指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻各品種之間遺傳距離為0.079 2?0.600 4，UPGMA聚類分析將11份樣品分為兩大組群，而貴州省天麻一群又被分為2個子群。關萍［49］分析了引自云南、貴州、四川、遼寧和陜西4省的27份天麻樣品的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)不同產區(qū)天麻樣品之間具有一定的遺傳多樣性，多態(tài)性比率為78%，遺傳距離為0.018 7?0.593 0；其中貴州省天麻樣品的遺傳差異大于其他省份，暗示貴州省產區(qū)基因資源相對豐富，是遺傳改良及良種選育的重要種質基礎，施秉與大方的天麻樣品遺傳距離最大，為0.593 4，桐梓與梵凈山的遺傳距離最小，為0.000 8；AFLP分析結果表明，不同變型天麻在分子水平上差異不明顯，暗示天麻種內的變型僅僅是表型上的變異，尚未在遺傳上固定下來。程紀倫等［50］利用AFLP技術對23份野生天麻樣品進行遺傳差異分析，獲得約72%的多態(tài)性位點，表明貴州省野生天麻種質資源的遺傳多樣性豐富，與鄒佳寧等［42］利用RAPD技術研究天麻種質的遺傳差異得出的結果相差不大，多態(tài)性位點為70.97%。趙永亮等［51］用AFLP和RAPD技術研究不同主產區(qū)的7份栽培天麻和2份野生天麻的遺傳差異和聚類情況，結果發(fā)現(xiàn)2種方法得到的聚類圖相似，能明顯區(qū)分不同海拔高度和產區(qū)的樣品，此外，發(fā)現(xiàn)天麻、蜜環(huán)菌二者間沒有共同條帶，表明它們之間不存在DNA的相互作用。季景玉［36］運用AFLP分子標記對天麻不同種質進行研究，結果發(fā)現(xiàn)天麻群體內的相似系數為0.79?0.86，遺傳距離最小的是紅桿天麻與綠桿天麻，遺傳距離最大的是紅桿天麻與卵果天麻，該結果與同工酶分析結果相符。

2.4.3 微 衛(wèi) 星DNA（Simple sequence repeat，SSR）微衛(wèi)星DNA又稱為SSR簡單重復序列，真核生物基因組中含有大量的簡單重復序列，通常由1?4個堿基組成，最常見的為（GA）n、（AC）n等雙核苷酸重復序列。SSR標記以DNA的形式直接出現(xiàn)，不受季節(jié)、環(huán)境的影響，不存在是否表達的問題，在天麻的不同發(fā)育時期組織均能檢測到，并且結果可靠，試驗重復性好，檢測位點多，供試材料需要量少，具有經濟、省時、高效、準確等優(yōu)勢，在天麻種質資源鑒定、遺傳圖譜構建、遺傳差異分析等方面應用廣泛［20］。目前，因為天麻的基因組信息有限，SSR標記的開發(fā)受到影響，隨著高通量技術的發(fā)展，越來越多的天麻基因組將被測序，更有利于遺傳多樣性的研究。

陳琦等［52］應用SSR技術研究貴州省栽培和野生天麻的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)栽培天麻和野生天麻的遺傳相似度較接近，栽培天麻的變異度相對較大。陳祖云等［53］采用SSR技術分析貴州省4個居群的野生天麻和栽培天麻，發(fā)現(xiàn)有性繁殖天麻均擴增出2條帶，為雜合子；無性繁殖天麻及野生天麻只能擴增出1條帶，為純合子，表明該技術能明顯區(qū)分栽培及野生天麻、有性繁殖及無性繁殖天麻。

周天華等［14］采取SSR分子標記方法研究烏、紅、綠3種變型天麻，12個種群的遺傳多樣性，并構建DNA指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)天麻在種群間和變型間分化現(xiàn)象均較明顯，均存在較高的遺傳多樣性。王曉麗等［54］采用SSR技術研究天麻親本及其雜交種F1代，發(fā)現(xiàn)雜交種F1代表現(xiàn)出親本互補帶型，能明顯區(qū)分于其親本材料。吳會芳［55］運用SSR標記檢測6個人工居群和8個自然居群共483份天麻樣品，共擴增出77條清晰、重復性高的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶64條，多態(tài)位點百分比為83.12%；遺傳多樣性研究結果顯示，天麻自然居群（Ho=0.06，He=0.53）與栽培居群（Ho=0.16，He=0.47）均表現(xiàn)為雜合子的嚴重缺乏，栽培居群的平均有效等位基因（Ae=2.59）和平均等位基因（A=4.20）均低于自然居群（Ae=2.62，A=5.05），檢測到栽培居群中的特有等位基因比自然居群少27個，表明栽培居群的遺傳基礎相對狹窄，遺傳均質性問題明顯。Xu等［21］設計了32對引物，并對8個野生種群的32個個體進行了SSR分析，共發(fā)現(xiàn)13個微衛(wèi)星座高度多態(tài)性，每個座3?10個等位基因，基因多樣性0.400?0.841。Chen等［20］采用微衛(wèi)星標記技術對天麻居群的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)天麻居群內的多樣性明顯低于其他蘭科植物，在總的遺傳多樣性中天麻居群間的貢獻率達20%。

2.4.4 簡單重復序列間區(qū)（Inter simple sequence repeat，ISSR）ISSR標記技術是1994年由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz在SSR標記的基礎上提出的一種新型分子標記技術，該技術分析的是一段短的位于2個簡單重復序列之間的DNA序列多態(tài)性［56］。該技術以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的兩端加錨隨機核苷酸，PCR反應過程中，錨定引物引起特異位點退火，造成不太大的與錨定引物互補的SSR序列之間的基因片段進行PCR擴增，擴增的條帶經電泳能展現(xiàn)基因組內多個位點的序列多樣性［57］。ISSR標記具有SSR和RAPD的優(yōu)勢，即具有多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性較高，通用性強，樣品用量少，不需要試劑盒，試驗成本低，操作簡單，結果便于記錄等優(yōu)點［58］，在天麻種質資源鑒定以及遺傳多樣性研究中應用廣泛。

關萍等［59］采取ISSR分子標記方法分析貴州省產區(qū)9個種群天麻的遺傳多樣性，共擴增出清晰的、大小為200?1 600 bp的譜帶120條，其中具有多態(tài)性的為97條，多態(tài)位點百分率達80.83%，揭示天麻在物種水平上的遺傳多樣性較高，種群間則較低，多態(tài)百分率為17.50%?40.83%，平均值為25.56%；經測算，物種水平上的Nei’s遺傳多樣性（He）為0.042? 0.153，平均為0.073；Nei’s基因分 化系數（G）為0.637 7，表明天麻種群間的遺傳變異占總變異的63.77%，而種群內的遺傳變異占總變異的36.23%。吳會芳［55］運用ISSR標記檢測6個人工居群和8個自然居群共483份天麻樣品，共檢測出77條重復性好、清晰穩(wěn)定的DNA帶譜，其中有64條多態(tài)性帶譜，總的多態(tài)性率為83.12%，遺傳多樣性分析結果顯示人工栽培天麻居群的遺傳多樣性參數明顯低于自然居群，暗示栽培居群遺傳基礎狹窄，遺傳均質性現(xiàn)象明顯；聚類分析將栽培居群與自然居群聚為兩大類群，說明二者之間存在明顯的分化。李相陵［45］通過試驗構建了ISSR-PCR反應體系，篩選出2個擴增效果好的ISSR引物，在對12份天麻樣品進行ISSR-PCR擴增時得到大小為200?2 000 bp的條帶128條，多態(tài)位點百分率為66.7%?88.9%；聚類圖將紅天麻與烏天麻各聚為一類，與RAPD結果基本相符。陳祖云等［60］采用ISSR標記技術分析貴州省產區(qū)野生、栽培天麻之間的遺傳關系，構建指紋圖譜，共篩選出有效引物4個，于23份供試天麻中檢測到32個位點，其中多態(tài)性位點29個，多態(tài)率為90.63%；聚類分析結果表明，23個居群的相似性系數為0.13?1.00，不同產區(qū)綠天麻、烏天麻的變異程度較高，紅天麻、黃天麻的變異程度較低，野生綠天麻與栽培天麻的遺傳距離較遠。

2.4.5 相關序列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）SRAP標記基于PCR擴增技術，針對啟動子和內含子AT含量豐富而外顯子GC含量豐富的特點設計引物對基因開放閱讀框區(qū)域進行擴增，因不同物種或者個體內含子和間隔區(qū)域長度的不同而呈現(xiàn)多態(tài)性。SRAP技術提出于2001年，具有多態(tài)性高、重復性好、在基因中分布均勻、可兩兩組合提高引物效率、引物通用等優(yōu)點，已廣泛應用于種質資源的重要性狀基因標記、遺傳圖譜的構建、評價鑒定等方面，但在天麻中的應用還比較局限。

鄧薇等［61］采用SRAP技術研究3個不同變型天麻的遺傳關系，結果篩選出SRAP引物7對，通過PCR擴增11批天麻樣品，得到清晰條帶145條，其中具有多態(tài)性的為110條，多態(tài)百分率達75.86%；UPGMA聚類分析將紅天麻與綠天麻聚為一類，烏天麻聚為一類，表明3個不同變型的天麻中，烏天麻與綠天麻、紅天麻的遺傳差異較大，親緣關系較遠，而紅、綠天麻之間具有相對較近的親緣關系。黃萬兵等［62］利用cDNA-SRAP技術研究蜜環(huán)菌與紅天麻共生前后的差異表達基因情況，發(fā)現(xiàn)未被侵染白麻在轉錄水平獲得64條特異的差異條帶，被侵染的白麻為53條，從被侵染白麻的差異表達基因片段STDFs中選取31個穩(wěn)定片段進行TA克隆以及序列比對分析，根據功能預測可分為7類，即未知功能、轉錄調控、細胞膜通透性、染色質重塑、能量與代謝、自交不親和性及抗性相關基因，部分cDNA-SRAP表達譜結果也與S-TDFs熒光定量（qPCR）結果一致，表明該技術能有效分析蜜環(huán)菌與天麻共培養(yǎng)時差異表達基因，可作為一種有效手段分析二者的共生分子調控機制。柴錕等［63］通過SRAP技術研究天麻的遺傳多樣性，提出天麻生態(tài)型間的變異要小于生態(tài)型內，而同一生態(tài)型天麻之間，烏天麻和綠天麻的遺傳性變異高于紅天麻。

2.4.6 內 轉 錄 區(qū) 間（Internal transcribed spacer，ITS）ITS標記常用于研究藥用植物系統(tǒng)發(fā)育、種間和種內、近緣屬的遺傳多樣性，具有快速、準確、擴增成功率高、標準化、便于高通量測序與分析、引物通用性強等優(yōu)點。

謝淵等［64］利用ITS技術研究天麻的遺傳差異性，發(fā)現(xiàn)天麻地域分布與其遺傳變異特征相關，暗示ITS序列可為天麻野生資源道地性鑒別以及品種鑒定提供依據，在后來的研究［65，66］中證實了此觀點。王德信［65，66］利用ITS標記鑒定黃、綠、烏3種變型天麻并分析其遺傳關系，結果發(fā)現(xiàn)綠天麻和黃天麻的遺傳距離約為25，構成2個姊妹群，與烏天麻的遺傳距離約為50，且不同變型間的遺傳距離均達100%的置信度；在ITS1的209個堿基中僅發(fā)現(xiàn)15個變異位點，相同堿基數目為92.8%，表明這15個變異位點可用于鑒定不同變異類型天麻；在對不同變異類型天麻的親緣關系進行分析時發(fā)現(xiàn)，烏天麻較為古老，綠天麻較為進化，黃、綠天麻均由烏天麻進化而來。唐科民［67］研究發(fā)現(xiàn)ITS標記可用于鑒別不同居群天麻，ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，天麻ITS序列在變型內和變型間僅有少部分個體變異較大，大部分個體變異較穩(wěn)定，變異大多發(fā)生在ITS1區(qū)；不同變型內，烏天麻和黃天麻具有較穩(wěn)定的遺傳變異，方便開展天麻的良種選育，綠天麻的遺傳變異最大；貴州省大方天麻與昭通天麻的親緣關系較近，與陜西省漢中市天麻的親緣關系相對較遠，同一產區(qū)不同變型間的ITS序列具有較高的同源性，不同產區(qū)相同變型的ITS序列差異相對明顯。

2.4.7 單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）SNP多態(tài)性主要是指生物基因組中因單個核苷酸的突變所導致的DNA序列多態(tài)性，是基因組中最常見的變異類型，能有效揭示種群的進化進程，是一種用于單體型推斷與統(tǒng)計分析、種群遺傳多樣性、自動化篩選、物種鑒定的新型標記方法。與其他標記相比，該技術不僅能分析單個堿基的突變，而且具有結果準確、標準化、客觀、位點豐富、便于高通量測序與分析、遺傳穩(wěn)定性較高、快速、擴增成功率高、變異容易解釋、引物通用性強、容易與線粒體DNA區(qū)別等顯著優(yōu)點，因此可用于分析近緣種或者不同基因型品種之間的遺傳多樣性［68］，被稱為第三代遺傳標志。

叢琨等［69］基于SLAF測序創(chuàng)始性地在天麻種質資源中獲得SLAF標簽并開發(fā)SNP標記，共獲得高質量的SLAF標簽471 001個，reads數據75.95 M，其中19 675個多態(tài)性SLAF標簽，并開發(fā)出群體SNP 60 238個，對SNP標記進行分析，結果顯示人工培育天麻的遺傳進化體系與其他天麻資源差異較大；所有天麻資源的SNP標記雜合率均高于20%，暗示天麻資源具有廣泛的雜合性。

3 展望

目前，國內從細胞學、形態(tài)學、生化水平以及DNA分子水平上均涉及了對天麻遺傳多樣性的研究，揭示了天麻的遺傳多樣性較豐富，為今后天麻種質資源的基因改良、遷地保護、育種選優(yōu)、開發(fā)及利用等方面的研究提供重要的理論依據，但在天麻的遺傳多樣性研究中仍存在一些不足。

3.1 綜合多種分子標記手段分析天麻遺傳多樣性

中國天麻種質資源豐富，通過表型性狀、細胞、生化以及分子標記均能在一定程度上分析其遺傳多樣性，但各有千秋。形態(tài)學標記作為傳統(tǒng)的遺傳標記方法之一，在植物分類及遺傳多樣性研究中起著不可替代的作用，在天麻遺傳分析研究中主要涉及產量分析以及相關性研究、資源分類以及鑒定等方面。在細胞水平上，僅涉及與天麻的共生關系、減數分裂、染色體數目等，有關不同產地、不同天麻變型資源之間的差異未見報道。采用生化標記方法進行生物遺傳多樣性研究時，供試材料需要量少，能有效避免表型分析和細胞學研究受材料影響的不足，但其分辨率、準確性低于分子標記。分子標記作為研究遺傳多樣性的一種新型方法，在天麻的遺傳多樣性分析中應用廣泛，但使用最為頻繁的是AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR幾種方法，具有一定的局限性，且大部分僅采用1種分子標記方法進行研究，于研究結果而言，具有不穩(wěn)定性、片面性。王德信［43，66］曾利用多種DNA分子標記方法研究綠、黃、烏3種變型天麻的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性變異位點數最少的為烏天麻，最多的為綠天麻；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示遺傳關系較近的是黃、綠天麻，這與形態(tài)學標記得出的綠、烏天麻遺傳關系較近的結論有差異。

目前結合分子標記技術和常規(guī)方法對天麻種質資源的遺傳多樣性方面的研究仍較為鮮見。利用DNA分子標記技術已經能鑒別部分不同分型天麻，并能得到不同分型天麻的親緣關系和遺傳差異，遺傳變異豐富的生態(tài)型可作為遺傳改良的基礎。然而通過分子標記方法仍無法檢測全部生態(tài)型，且費用昂貴，因此，需聯(lián)合多種遺傳多樣性分析方法開展天麻輔助育種及遺傳多樣性研究。

3.2 建立天麻多樣性評價標準

天麻具有重要的食用價值、藥用價值以及經濟價值，研究其遺傳多樣性不僅有利于分析天麻的遺傳關系，了解物種的瀕危情況，還有利于良種選育、資源保護和產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。天麻的遺傳多樣性評價缺乏統(tǒng)一標準，研究方法以及評價標準各不相同，很難全面、精確地評價各資源的遺傳多樣性，若要將遺傳多樣性評估結論運用到天麻資源保護及開發(fā)利用中，還需要建立多樣性評價體系。將來的研究中，遺傳標記方法的綜合利用將在天麻的溯源體系建立、地理起源推斷、物種進化及適應性研究、新種發(fā)現(xiàn)與鑒定等方面發(fā)揮重要作用。同時，應提倡保護性采集，提高仿野生種植技術，強化生物發(fā)酵物、蜜環(huán)菌等替代產品開發(fā)，從源頭上保護天麻野生資源的遺傳多樣性。