張柯，胡巔

(河南省疾病預防控制中心，河南 鄭州 450016)

氯己定屬于雙胍類高效廣譜消毒殺菌劑，其為陽離子表面活性劑，具有強的廣譜抑菌、殺菌作用，尤其對革蘭陽性和陰性菌的抗菌，廣泛應用于皮膚黏膜的消毒[1]。目前，氯己定單方制劑使用較少，常與其他消毒劑復配使用，復配成分有羥苯酯、季銨鹽和中成藥等[2]。氯己定復配后成分復雜，難以控制消毒劑的質量，因而需要建立準確可靠的分析方法。

傳統(tǒng)檢測氯己定的方法有滴定法[3]和分光光度法[4-5]。高效液相色譜法采用先分離后測定的模式，近年來已經成為氯己定消毒劑測定的首選方法，目前主要應用于醋酸氯己定消毒劑的分離與含量測定。楊寧輝等[6]以乙醇-乙酸水溶液為溶劑，超聲提取樣品中的醋酸氯己定和苯扎氯銨。采用Symmetry C18色譜柱，乙腈-丁烷磺酸鈉水溶液流動相，260 nm波長測定復配消毒軟膏中醋酸氯己定和苯扎氯銨。建立的離子對液相色譜法能夠準確靈敏地測定復配消毒軟膏中醋酸氯己定和苯扎氯銨的含量，該方法線性范圍寬、選擇性強，具有良好的準確度和精密度。夏方亮[7]采用C18柱為固定相，以甲醇-水-三乙胺(65∶35∶0.3，含0.01 mol·L-1庚烷磺酸鈉，用磷酸調節(jié)pH 4.0)為流動相，建立高效液相色譜法測定醋酸氯己定碘醇溶液中醋酸氯己定的含量測定方法。上述研究方法在流動相中加入了離子對試劑，增加了保留時間和改善色譜峰型，缺點是離子對試劑在色譜儀中易殘留，影響色譜柱和檢測器壽命。彭賢東等[8]采用Atlantis C18柱，流動相為乙酸銨-甲醇，建立準確可靠的高效液相色譜法同時測定復方水楊酸硫乳膏中水楊酸和醋酸氯己定的含量，分離效果良好。與醋酸氯己定相比，葡萄糖酸氯己定具有水溶性好、刺激性小的優(yōu)點，市場上逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的醋酸氯己定，應用范圍和市場占比逐年擴大，但其檢測方法的研究目前較少[9-10]。建立復配消毒劑中葡萄糖酸氯己定準確可靠的檢測方法，對評價產品質量、開發(fā)新型產品具有重要的意義，本文通過優(yōu)化高效液相色譜流動相條件，以醋酸銨-醋酸緩沖液(0.02 mol·L-1，pH=4.0，加入體積分數為5‰的三氯乙酸)和乙腈為流動相，建立復配消毒劑中葡萄糖酸氯己定含量的測定方法，研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑高效液相色譜儀(LC-20，島津公司)、電子天平(賽多利斯公司，型號BSA224S)、超聲波清洗儀(Elma公司，型號P30H)、pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司，型號PHS-25)、恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號HSY)。葡萄糖酸氯己定(Sigma-Aldrich公司)，乙腈(色譜純，阿拉丁公司)，乙醇、三氟乙酸、醋酸鹽緩沖鹽均購自國藥集團，實驗用水為石英亞沸蒸餾水(自制)。

1.2 儀器條件Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為醋酸銨-醋酸緩沖液(0.02 mol·L-1，pH=4.0，加入體積分數為5‰的三氯乙酸)，流動相B為乙腈，等度洗脫(A+B=80+20)；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL·min-1；二極管陣列檢測器波長258 nm。

1.3 標準系列電子天平精密稱到葡萄糖酸氯己定標準溶液1.00 g，去離子水定容于10.0 mL容量瓶中，搖勻后得到質量濃度為20.0 g·L-1的標準品儲備液。移液槍分別吸取上述適量對照品標準儲備液于100 mL容量瓶中，去離子水定容。配制濃度為5.0 、20.0、50.0、100.0、200.0和500.0 mg·L-1的標準使用液。

1.4 樣品的測定精密稱取1.0 g葡萄糖酸氯己定復合消毒劑產品于100 mL容量瓶中，加入80.0 mL體積分數為80%的酒精，醋酸調節(jié)pH為4.0，在水浴鍋中50 ℃超聲提取10 min，冷卻到室溫后，采用體積分數為80%的酒精水溶液定容，過0.45 μm濾膜后上機測試。

2 結果

2.1 專屬性實驗按1.2部分設置色譜儀器條件，配制標準品上機測試，葡萄糖酸氯己定標準品的色譜圖和紫外可見吸收光譜如圖1所示，葡萄糖酸氯己定標準品的保留時間為3.128 min，標準品色譜圖中無其他雜質峰出現，紫外可見吸收光譜的最大特征吸收特征波長為258 nm。

樣品處理后上機測試，其液相色譜圖和紫外可見吸收光譜如圖2所示，樣品中葡萄糖酸氯己定的保留時間為3.227 min，與圖1標準品的保留時間基本一致，兩者保留時間的相對偏差<5%。樣品中待測物和雜質的分離度良好(R>1.5)，雜質基本不干擾葡萄糖酸氯己定的測定。通過比較標準品與樣品的吸收光譜，進一步做定性鑒別，樣品中葡萄糖酸氯己定的吸收光譜與標準品的吸收光譜圖的輪廓基本一致，其最大特征吸收波長均為258 nm。樣品的紫外可見吸收光譜顯示，葡萄糖酸氯己定峰的純度>99%，無其他雜質吸收峰的干擾，檢測方法的專屬性良好。

2.2 流動相的優(yōu)化反相液相色譜中，流動相的選擇對分離起到至關重要的作用，流動相的種類和組成影響待測組分在色譜柱上的保留時間和色譜峰的峰形，如圖3所示，采用磷酸緩沖液(體積分數為70%)-乙腈(體積分數為30%)為流動相時，葡萄糖酸氯己定的色譜峰較寬，基線噪聲較高，并且色譜峰有明顯的拖尾現象。

葡萄糖酸氯己定在水中解離出陽離子，目前的檢測方法是加入離子對試劑，但會造成色譜柱的操作。實驗采用添加了5‰三氟乙酸的醋酸鹽緩沖液(80%)-乙腈(20%)為流動相來優(yōu)化流動相條件，葡萄糖酸氯己定的色譜峰如圖1所示，色譜峰型正態(tài)分布，對稱性良好，半峰寬較窄，無色譜峰前展和拖尾現象。

2.3 檢測限與定量限在空白樣品中加入的標準溶液，樣品中葡萄糖酸氯己定的質量濃度為10 mg·L-1。按照1.2設定的儀器條件，進樣后記錄色譜峰高和基線的噪聲，將樣品逐級稀釋，當信噪比(S/N)為3時確定為方法的檢測限，S/N為10時定為方法的定量限。重復測定3次，得到儀器的噪聲和測定的平均結果，計算出方法檢測限為0.5 mg·L-1，方法定量限為2.0 mg·L-1。

2.4 校正曲線在1.2的儀器條件下進樣標準系列，記錄各個標準點的色譜圖峰面積。以葡萄糖酸氯己定的質量濃度為橫坐標，相應的色譜峰面積為縱坐標，作線性回歸曲圖，最小二乘法線性擬合并回歸分析，得到葡萄糖酸氯己定的工作曲線。當葡萄糖酸氯己定質量濃度在5～500 mg·L-1時，擬合曲線的線性關系良好，工作曲線的回歸方程為y=17 856.2.3x+3 564.5，擬合的相關系數r等于0.999 4。

2.5 樣品的檢測準確稱量2種市售復合葡萄糖酸氯己定樣品，按照1.4部分處理樣品后，將樣品中葡萄糖酸氯己定稀釋到標準曲線線性范圍，經0.45 μm直徑濾膜過濾后上機測定。將樣品與標準品的色譜保留時間和PDA檢測器光譜圖進行對比，對樣品中存在的葡萄糖酸氯己定進行定性分析，標準曲線法定量，檢測結果見如表1，2種樣品中葡萄糖酸氯己定的含量分別為0.57%和0.48%，平行測定偏差在允許差范圍內，樣品中葡萄糖酸氯己定含量在廠家標識范圍內，該產品中葡萄糖酸氯己定含量合格。

2.6 準確度和精密度配制合適濃度的樣品溶液，在優(yōu)化的儀器條件下，連續(xù)進樣7針樣品溶液，記錄葡萄糖酸氯己定的峰面積，計算7針色譜峰面積的相對標準偏差，考察色譜條件的系統(tǒng)適用性，實驗結果表明，連續(xù)進樣7針時葡萄糖酸氯己定標準品的峰面積的相對標準偏差值(n=7)為4.2%，色譜峰保留時間的相對標準偏差值(n=7)小于0.2%，檢測方法的重現性良好。

按照所設定的樣品前處理方法和優(yōu)化的色譜條件分別測試樣品，計算樣品中葡萄糖酸氯己定的含量為0.48%。采用樣品加標實驗來驗證方法的準確度，樣品加標分為低、中和高3個水平加標，其中低水平加標為樣品含量的一半，中水平加標為樣品含量，高水平加標為樣品含量的2倍，考察不同含量下的加標回收率，評價方法的準確性。將加標后樣品提取液稀釋到標準曲線范圍內，由標準曲線得到加標后溶液含量，計算樣品加標回收率和平均加標回收率。如表2所示，樣品加標回收率為92.5%～101.3%，該檢測方法的準確性較好。

3 討論

常用的氯己定類消毒劑有鹽酸氯己定、醋酸氯己定和葡萄糖酸氯己定，其中鹽酸氯己定和醋酸氯己定在水中的溶解度較小(<2%)，而葡萄糖酸氯己定的水溶解好(20%)，適合與其他水溶性消毒劑復配，形成復合溶液、膏體和凝膠等多組分劑型。復配消毒劑可作為殺菌消毒劑，用于醫(yī)療器械和皮膚的消毒劑，具有毒性低、刺激性小等優(yōu)點。《消毒技術規(guī)范2002》采用磷酸緩沖鹽和乙腈為流動相檢測醋酸氯己定，乘以換算系數計算葡萄糖酸氯己定，但由于葡萄糖酸氯己定溶解度與醋酸氯己定差異較大，其樣品前處理和色譜保留性能與醋酸氯己定有所差異，葡萄糖酸氯己定測定方法還有待于深入開展。鑒于葡萄糖酸氯己定逐漸取代醋酸氯己定的國內外發(fā)展趨勢，研究葡萄糖酸氯己定的樣品提取和準確可靠的測定方法，對加強葡萄糖酸氯己定的產品質量控制有著重要的應用價值。

葡萄糖酸氯己定在溶劑中離解為氯己定陽離子和葡萄糖酸陰離子，氯己定陽離子與C8色譜柱固定相上的殘存硅醇基產生靜電作用，影響色譜分離性能，造成色譜峰嚴重拖尾、保留時間重現性差等現象。采用離子對色譜法可以提高離子型化合物的分離系數，改善分離效果。烷基磺酸鈉是廣泛應用于反相離子對色譜的陰離子對試劑，但離子對試劑對色譜系統(tǒng)的性能影響較大，若沖洗不及時和完全會造成色譜柱壽命的縮短和檢測器的老化。本研究采用醋酸銨為流動相，加入三氟乙酸溶劑改良劑，替代離子對試劑的功能，醋酸鹽解離出的醋酸根陰離子，三氟乙酸解離的F離子，均能夠與氯己定陽離子形成中性離子對，改善氯己定在C18色譜柱上的保留性能，減小使用表面活性劑離子對試劑所造成的色譜柱和檢測器使用壽命的損失，增強檢測方法的適用性。

單純的氯己定屬于低效消毒劑，但與乙醇等其他消毒成分復合后，能夠產生協(xié)同增加作用，達到中效消毒劑水平。葡萄糖酸氯己定與其他消毒劑復合后，能夠擴大消毒劑的使用范圍和作用效果，擴展其使用范圍。但復配后消毒劑的基質成分變得更為復雜，對分析檢測的方法提出更高的要求，需要選擇更為合適的儀器條件。二極管陣列檢測器光譜掃描結果發(fā)現，葡萄糖酸氯己定在205、231和258 nm處有吸收，其中波長258 nm為最大特征紫外可見吸收波長。相比較205 nm和228 nm，采用258 nm波長檢測時的背景吸收較小，實驗選擇258 nm作為葡萄糖酸氯己定的測定波長，在該檢測波長下，消毒劑中其他成分并不干擾測定，方法的專屬性良好。通過優(yōu)化色譜流速，柱溫和流動相比，建立了葡萄糖酸氯己定含量測定的色譜法，該方法應用于復配凝膠消毒劑中葡萄糖酸氯己定的測定，效果令人滿意。