楊家發(fā)，朱義通，陸兆豐

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院開元院區(qū) 急診科，河南 洛陽 471000）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）由序貫觸發(fā)隨時間－空間動態(tài)演進(jìn)的原發(fā)傷及繼發(fā)傷構(gòu)成［1－2］。創(chuàng)傷后神經(jīng)炎癥在損傷后幾分鐘內(nèi)啟動，其特征是相關(guān)分子模型（damage－associated molecular patterns，DAMPs）損傷，細(xì)胞因子和趨化因子上調(diào)和分泌，中性粒細(xì)胞和其他髓樣細(xì)胞浸潤，以及膠質(zhì)細(xì)胞激活和白細(xì)胞募集［3］。隨后產(chǎn)生的抗炎遞質(zhì)和內(nèi)源性保護(hù)劑抑制了體液和細(xì)胞免疫激活。除了浸潤的外周血細(xì)胞外，小膠質(zhì)細(xì)胞也被激活。這些活化的小膠質(zhì)細(xì)胞有助于清除細(xì)胞碎片，促進(jìn)組織重塑，而激活的小膠質(zhì)細(xì)胞也釋放各種神經(jīng)毒性物質(zhì)，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（nitrogen species，RNS）和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（如谷氨酸），這可能加劇神經(jīng)元死亡。此外，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移，以及腦外傷后神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的發(fā)展損害了軸突的再生［4］。復(fù)雜的星形膠質(zhì)增生和免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移到損傷部位可以通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)組織修復(fù)和神經(jīng)再生，也可以通過增加炎癥機(jī)制加劇組織損傷。包含caspase募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis－associated speck－like protein containing CARD，ASC）是一種參與炎癥小體組裝和焦亡的銜接蛋白［5］。本文就ASC功能特點及其在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用進(jìn)行綜述。

1 ASC功能特點

1.1 寡聚化 ASC斑點形成是炎癥小體激活的標(biāo)志，ASC由一個pyrin結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD）和一個CARD組成。ASC在低pH和混沌劑溶液中可溶于單體，靜息狀態(tài)下，高能量壁壘阻止其自發(fā)性寡聚［6］。炎癥小體傳感器能夠形成一個低聚的PYD簇，作為種子并招募ASC分子形成螺旋狀細(xì)絲，炎癥小體傳感器分子的激活導(dǎo)致構(gòu)象的改變，或通過與共同配體結(jié)合使幾個炎癥小體傳感器分子緊密結(jié)合，導(dǎo)致PYD自身相互作用。ASC向傳感器募集的調(diào)節(jié)和ASC－PYD線性聚合的干擾觸發(fā)炎癥反應(yīng)所需的閾值。一旦達(dá)到可調(diào)閾值，ASC組裝成線狀細(xì)絲和它們的縮合成大分子ASC斑點促進(jìn)全或無式響應(yīng)［7］。這些結(jié)構(gòu)是高度調(diào)控的，并提供了一個獨特的信號平臺，以控制caspase－1和可能的其他效應(yīng)器的活性。傳感器分子被認(rèn)為可以降低ASC齊聚的高能量壁壘，并通過類似朊病毒的傳播導(dǎo)致無限制的ASC聚合，以電荷屬性為基礎(chǔ)的相互作用決定了PYD相互作用的界面屬性［8］。1.2 ASC組裝形成斑點 ASC斑點在特定時空條件下呈現(xiàn)不同的寡聚化組裝，是NOD樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3（NOD－，LRR－and pyrin domaincontaining protein 3，NLRP3）炎癥小體激活的關(guān)鍵步驟［9］。低聚化NLRP3通過同型PYD相互作用招募ASC，并形成螺旋形ASC絲。多個ASC細(xì)絲聚合成一個大分子焦點，稱為ASC斑點。ASC斑點是前caspase－1招募和激活的位點，可以從細(xì)胞中釋放出來，在細(xì)胞外空間傳播炎癥，或在其他細(xì)胞中由核內(nèi)體內(nèi)化和釋放，PYD鏈間界面電荷屬性系區(qū)域聚合時構(gòu)象變化的基礎(chǔ)，而CARD是斑點形成和下游信號的必要條件［10］。解離常數(shù)表明ASC－PYD對NLRP3－PYD有較強(qiáng)的親和力，ASC與NLRP3的相互作用增強(qiáng)了ASC斑點的形成，導(dǎo)致炎癥小體和caspase－1的激活［11］。作為炎癥小體下游激活信號，ASC斑點的組裝本身并不是caspase－1激活的必要條件。在ASC缺陷細(xì)胞中，NLRC4（NLR family，CARD domain containing 4）或NLRP1b的CARD直接招募前caspase－1，或NLRP3招募聚合缺陷ASC突變體，足以激活caspase－1依賴的焦亡［8，12］。前caspase－1的蛋白水解過程，以及IL－1β的釋放對典型炎癥小體激活物AIM2（absent in melanoma 2）、NLRC4和NLRP3的響應(yīng)，都依賴于ASC斑點。被激活的神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP）／NLRC4環(huán)提供了10～12個NLRC4的CARD域，這些域被認(rèn)為是招募前caspase－1的，但這種排列似乎不足以自動催化caspase－1的激活。這表明ASC斑點以不同的方式招募前caspase－1以促進(jìn)caspase－1成熟。ASC斑點可能招募更多的比前caspase－1更小的復(fù)合物，以達(dá)到足夠的局部濃度。ASC斑點可能通過許多CARD（如caspase－1）與CARD相互作用招募前caspase－1，或者可能提供多個或少量的CARD聚合體，使體外觀察到的caspase－1－CARD絲有核。caspase－1的蛋白水解過程將其催化活性提高了100倍以上，表明ASC斑點可以提供一個可以調(diào)節(jié)局部caspase－1活性的環(huán)境［13］。

NLRP3在炎癥小體中扮演核心作用，因為NACHT結(jié)構(gòu)域具有ATP酶活性，這對NLRP3的自我關(guān)聯(lián)和功能至關(guān)重要，而LRR結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為通過折疊狀NACHT結(jié)構(gòu)域（NAIP，CIITA，HETE and TEP1 domain）來誘導(dǎo)自身抑制［14］。NLRP3通過NACHT結(jié)構(gòu)域間的同型相互作用寡聚。組裝后的ASC通過CARD與CARD相互作用招募caspase－1，并使caspase－1接近誘導(dǎo)自裂解和激活［15］。caspase－1聚集在ASC上，在p20和p10之間的連接點自裂解，生成p33（包括CARD和p20）和p10的復(fù)合物，該復(fù)合物仍然與ASC結(jié)合并具有蛋白水解活性［16－17］。CARD和p20之間的進(jìn)一步處理從ASC釋放p20和p10。釋放的p20 p10異四聚體在細(xì)胞中不穩(wěn)定，因此終止其蛋白酶活性［18］。NIMA相關(guān)激酶7（NEK7），一種已知參與有絲分裂的絲氨酸－蘇氨酸激酶，被發(fā)現(xiàn)是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵［16，19］。低細(xì)胞數(shù)量級的NEK7與NEK9結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞分裂，在細(xì)胞分裂間期NLRP3暴露于初級信號后才與NLRP3結(jié)合，NEK7單獨不能激活NLRP3，ATP需要與NBD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這會使NEK7的S195磷酸化，使NLRP3采用其活性構(gòu)象進(jìn)行寡聚。當(dāng)NACHT域作為剛體從NACHT域旋轉(zhuǎn)離開時，會出現(xiàn)活性構(gòu)象，導(dǎo)致NEK7和NLRP3－NACHT域之間的接觸點減少。當(dāng)細(xì)胞參與轉(zhuǎn)化生長因子－β激活激酶1（TAK1）依賴的翻譯后啟動通路時，NLRP3激活不再需要NEK7。在炎癥小體激活時，NEK7與NLRP3相互作用增加，NEK7與NLRP3寡聚形成一種復(fù)合物，這對ASC斑點的形成和caspase－1的激活至關(guān)重要［20－21］。NLRP3炎癥小體時間動態(tài)演進(jìn)與蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)［22］。別構(gòu)行為和催化功能強(qiáng)烈依賴于蛋白質(zhì)動力學(xué)和結(jié)構(gòu)域間相互作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域動態(tài)參與催化、調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)組裝［23－24］。

2 ASC在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用

2.1 參與炎癥相關(guān)性細(xì)胞死亡 創(chuàng)傷性腦損傷后，包含CARD結(jié)構(gòu)域（如NLRP3）或包含PYD結(jié)構(gòu)域（如NLRC4）模式識別受體（PRRs）炎癥小體激活。寡聚化PRRs通過使ASC組裝成核，從而形成ASC斑點，通過ASC的CARD招募前caspase－1。ASC是caspase－1通過自動處理激活的關(guān)鍵。雖然加工和未加工的活化caspase－1都誘導(dǎo)焦亡，但只有加工的活化caspase－1能有效地將IL－1β、IL－18轉(zhuǎn)化為其成熟形式。炎癥小體通過caspase－1、caspase－8及其底物誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和凋亡［25］，是繼發(fā)性腦損傷持續(xù)神經(jīng)功能惡化的分子基礎(chǔ)。而前期研究表明，同屬泛素化E3連接酶家族的三基序模體包含蛋白22基因敲除后，ASC及其caspase－1表達(dá)下調(diào)，從而保護(hù)神經(jīng)元免受氧糖剝奪／復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的凋亡和炎癥的影響［26］。

2.2 介導(dǎo)神經(jīng)血管單元細(xì)胞間的細(xì)胞通信 腦周細(xì)胞－內(nèi)皮界面的三維超微結(jié)構(gòu)顯示：形成血腦屏障的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞位于免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交界面，在免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能整合中發(fā)揮重要作用［27］。Nagy?szi等［28］描述了在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（cerebral endothelial cells，CECs）中NOD樣受體和炎癥小體成分的表達(dá)譜和調(diào)控。此外，首次證明炎癥小體可以在CECs中以絲裂原活化蛋白激酶依賴的方式被激活，從而導(dǎo)致IL－1b活躍分泌。CECs中炎癥小體的激活是一種尚未確定的，但可能是血腦屏障調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫軸的重要機(jī)制。通過細(xì)胞黏附分子的上調(diào)和促炎細(xì)胞因子的分泌，包括周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)血管單元細(xì)胞（neurovascular unit，NVU）積極參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)。如前所述，兩種細(xì)胞類型都可以通過規(guī)范途徑激活炎癥小體，即CECs，而周細(xì)胞只能通過非規(guī)范途徑激活［29］。炎癥小體依賴信號通過血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞從大腦向外周傳遞的直接證據(jù)，反之亦然。CECs和腦周細(xì)胞的相互激活可能導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌和血腦屏障破壞，激活周圍細(xì)胞，啟動免疫系統(tǒng)神經(jīng)炎癥，并將全身炎癥傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［30］。ASC在介導(dǎo)神經(jīng)血管單元細(xì)胞間的細(xì)胞通信中的作用有待進(jìn)一步研究。

2.3 信號銜接、級聯(lián)放大 創(chuàng)傷性腦損傷激活轉(zhuǎn)化反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過DAMPs誘導(dǎo)Toll樣受體－核轉(zhuǎn)錄因子－κB信號通路［3，31］，通過配體－受體反應(yīng)，傳感器分子招募ASC－PYD纖維的快速形成，將ASCCARD暴露在其表面，創(chuàng)造了大量的前caspase－1招募和激活位點［15］。Shiraishi等［32］研究認(rèn)為脊髓損傷后，神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，ASC缺失導(dǎo)致小鼠脊髓損傷后炎癥細(xì)胞因子表達(dá)顯著減少，運動功能顯著改善，ASC通過促炎級聯(lián)反應(yīng)在脊髓損傷后繼發(fā)性損傷的進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過ASC斑點的結(jié)構(gòu)和ASC細(xì)絲組裝機(jī)制，ASC絲的形成可能是炎癥小體信號的放大機(jī)制，這種放大作用有助于在細(xì)胞焦亡開始前產(chǎn)生足夠成熟的細(xì)胞因子。然而，整個ASC斑點組裝的結(jié)構(gòu)，包括受體、配體和調(diào)控機(jī)制仍然缺乏，是否有其他蛋白質(zhì)參與其形成尚不清楚。具有接頭作用的ASC蛋白為完整PYD及CARD結(jié)構(gòu)域提供磷酸化、泛素化、類泛素化修飾位點，ASC鉸鏈區(qū)靈活性允許兩個半蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同時與其他蛋白質(zhì)和多肽相互作用，并采用形成每個復(fù)合物所需的不同結(jié)構(gòu)域間排列組合模式［13］。

2.4 促炎因子釋放 繼發(fā)性腦損傷持續(xù)數(shù)小時至數(shù)年，神經(jīng)炎癥在NLRP3炎癥小體激活中有重要作用，各種串聯(lián)或獨立作用激活NLRP3上游信號，包括鉀離子或氯離子的外流、鈣離子內(nèi)流、溶酶體破壞、線粒體功能障礙、代謝變化等［14］。NLRP3招募ASC蛋白經(jīng)過寡聚、聚集成絲、自我組裝成斑點，形成完整炎癥小體，促進(jìn)炎癥因子釋放及細(xì)胞裂解后釋放炎癥因子。既往研究磷酸化、泛素化、類泛素化調(diào)控多集中在NLRP3蛋白，ASC蛋白PYD及CARD結(jié)構(gòu)域位點調(diào)控仍是新領(lǐng)域，值得深入研究。

3 總結(jié)與展望

創(chuàng)傷性腦損傷，特別是繼發(fā)性腦損傷，星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的激活，從而導(dǎo)致持續(xù)性神經(jīng)炎癥［32］。其中NLRP3炎癥小體為重要角色，NLRP3及ASC各級結(jié)構(gòu)域接受磷酸化、泛素化、類泛素化及翻譯后修飾等調(diào)控，使NLRP3穩(wěn)定在一種自動抑制的、不活躍的、但有信號能力的狀態(tài)［17］。繼發(fā)性腦損傷持續(xù)數(shù)小時至數(shù)年，持續(xù)性神經(jīng)炎癥導(dǎo)致持續(xù)性神經(jīng)功能受損，ASC在炎癥小體斑點聚合核心中，從某種意義上認(rèn)為，NEK7和NLRP3在炎癥小體中充當(dāng)引物作用，ASC的深入研究顯得尤為重要，提供了炎癥小體抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性和臨床潛力。并有助于利用基于配體或基于結(jié)構(gòu)的方法發(fā)現(xiàn)新的NLRP3抑制劑。