王子琳，唐子恒，林澤寧，劉文字，劉 戎，張嘉慧，沈祥廣*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，廣州 510642；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)，廣州 510642)

β-受體激動劑引起的食品安全問題是全世界關(guān)注的熱點。在食品動物飼養(yǎng)中，由于高劑量的β-受體激動劑可以加快脂肪的分解，提高動物的瘦肉率[1-2]，個別廠家非法將其添加至飼料中來提高食品動物的經(jīng)濟(jì)效益[3]。如今，β-受體激動劑作為促生長劑已在全球大約160個國家被禁止使用，包括中國、俄羅斯和部分歐洲國家等[4]。膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay,CGIA)具有方便、易操作、低成本、適用性強(qiáng)等特點[5]，因此常用于檢測動物組織或尿液中克倫特羅(clenbuterol，CLE)、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)和萊克多巴胺(ractopamine,RAC)3種β-受體激動劑(下文稱3種β-受體激動劑)等化合物，以確保動物源性食品的質(zhì)量安全。

在國家倡導(dǎo)減抗養(yǎng)殖的背景下，許多養(yǎng)殖場會使用中獸藥粉末或中藥制劑進(jìn)行疾病防控。例如在豬的飼料中添加杜仲、黨參、陳皮等中藥粉具有促進(jìn)豬只生長、增強(qiáng)免疫功能、提高酮體性能等方面作用[6-9]。在使用CGIA法檢測3種β-受體激動劑的過程中，有時會出現(xiàn)CGIA檢測呈陽性(即CLE、RAC、SAL至少有1種檢測呈陽性)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)復(fù)測時呈現(xiàn)未檢出的結(jié)果，即假陽性現(xiàn)象，針對這一現(xiàn)象的解釋和研究較少。筆者在前期試驗中發(fā)現(xiàn)，105種中藥材中，陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥的提取物β-受體激動劑CGIA檢測呈陽性，而在中藥飼喂動物試驗中，僅有飼喂了陳皮、青皮2種中藥后的豬尿液CGIA檢測出現(xiàn)RAC陽性反應(yīng)。陽性豬尿經(jīng)LC-MS/MS復(fù)測，未檢出RAC[10]。陳皮和青皮均含有一個中藥成分—辛弗林(synephrine，SYN)，可能是引起豬只尿液CGIA檢測3種β-受體激動劑出現(xiàn)假陽性的關(guān)鍵成分。為進(jìn)一步驗證陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥對CGIA法檢測β-受體激動劑的影響，本試驗采用LC-MS/MS法和小鼠肝微粒體體外模型，研究辛弗林對CGIA法檢測3種β-受體激動劑的影響，以期為獸醫(yī)臨床合理使用中藥提供參考，減少由中藥源引起的“瘦肉精”CGIA 檢測假陽性現(xiàn)象的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司。受試中藥購于廣州南北行中藥飲片有限公司。甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。小鼠肝微粒體(ICR/CD1)購于瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司。CLE、RAC、SAL 3種膠體金免疫層析檢測卡購于北京勤邦生物科技有限公司。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，型號Agilent 1290 Infinity Ⅱ搭配Agilent 6470 Triple Quad LC/MS，購于美國安捷倫科技有限公司。

1.2 溶液及配制

辛弗林標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取5.10 mg辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品(98%)，置于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為1 mg·mL-1的辛弗林儲備液，-20 ℃保存；儲備液使用前以超純水稀釋成不同濃度的辛弗林標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。PBS緩沖液(pH=7.4)：取磷酸二氫鉀1.36 g，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，用純水稀釋至200 mL。100單位六磷酸葡萄糖脫氫酶：取0.41 mg六磷酸葡萄糖脫氫酶(241 U·mg-1)，用5 mmol·L-1檸檬酸鈉溶液定容至2.5 mL，-80 ℃保存。co-factors溶液：取200 mg NADP+，200 mg六磷酸葡萄糖，133 mg氯化鎂，用雙蒸水定容至10 mL，-20 ℃下保存。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測中藥提取復(fù)溶液和豬尿中的辛弗林

1.3.1 豬尿中辛弗林的測定

1.3.1.1 液相色譜及質(zhì)譜條件:

a)色譜條件 色譜柱：Luna C18(2)(150 mm × 2.0 mm，5 μm)；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動相：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Mobile phase elution gradient

表2 辛弗林的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometric analysis parameters of synephrine

1.3.1.2 豬尿樣品前處理:取豬尿0.5 mL，加入乙腈9.5 mL，渦旋1 min，密閉，40 ℃水浴超聲30 min，2 800×g離心5 min，取離心后的上清液5 mL，氮吹至干，取0.5 mL流動相復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.3.1.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍:取空白豬尿，按上述步驟前處理獲得的空白豬尿基質(zhì)，將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成不同濃度，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.1.4 回收率和變異系數(shù)：移取空白豬尿0.5 mL若干份，分別加入濃度為0.5、2.5和5.0 μg·mL-1的辛弗林標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，制成添加濃度為0.1、0.5和1.0 μg·mL-1的空白添加樣品。按“1.3.1.2”方法處理，重復(fù)3批，計算回收率和變異系數(shù)。

1.3.1.5 測定：取飼喂中藥后CGIA檢測β-受體激動劑呈陽性的豬尿樣品6份，該豬尿為前期動物飼喂試驗中對105種中藥進(jìn)行篩查獲得的飼喂了陳皮和青皮的豬尿；陳皮和青皮按每只豬每天50 g的使用量(約為《中華人民共和國獸藥典》推薦劑量的5倍)，連續(xù)給藥3 d，于給藥后約6 h接取的豬尿。取豬尿0.5 mL，按“1.3.1.2”方法處理，進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析辛弗林含量。采用外標(biāo)法，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程定量。

1.3.2 中藥提取復(fù)溶液中的辛弗林含量測定 精密量取100 μg·mL-1辛弗林標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用流動相稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度3個重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

分別取陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥粉末2 g，各作3個平行樣。加乙醇-乙腈(1∶9，v/v)10 mL提取并濃縮[10]，復(fù)溶液過濾后用流動相稀釋，進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析辛弗林含量。采用外標(biāo)法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程定量，測定中藥提取復(fù)溶液中辛弗林的濃度。

1.4 小鼠肝微粒體對中藥CGIA檢測陽性成分的影響

出現(xiàn)假陽性的中藥提取復(fù)溶液以雙蒸水稀釋至CGIA檢測RAC呈陽性臨界濃度的10倍，備用。辛弗林添加陽性樣品：取CGIA法檢測β-受體激動劑呈陰性的2種中藥復(fù)溶液，分別添加適量辛弗林標(biāo)準(zhǔn)工作液(PBS稀釋)，用雙蒸水稀釋至CGIA檢測RAC呈陽性臨界濃度的10倍，備用。

將小鼠肝微粒體置37 ℃水浴解凍。于2 mL EP管中，將640 μL雙蒸水、100 μL PBS緩沖液(pH=7.4)、100 μL備用液和100 μL小鼠肝微粒體混合(反應(yīng)體系中的蛋白濃度為2 mg·mL-1)，置37 ℃水浴預(yù)孵育3 min后，分別加入10 μL 100單位六磷酸葡萄糖脫氫酶溶液和50 μL co-factors溶液，啟動反應(yīng)，繼續(xù)置37 ℃水浴中孵育。在啟動反應(yīng)后的0、1、2、3、4、5、6 h取樣進(jìn)行膠體金免疫層析檢測。每組3個平行。

對照試驗：取100 μL PBS緩沖液代替?zhèn)溆靡?，與640 μL雙蒸水、100 μLPBS緩沖液和100 μL小鼠肝微粒體混合制成不含中藥的對照；取100 μL 重懸緩沖液代替小鼠肝微粒體，與640 μL雙蒸水，100 μL PBS緩沖液和100 μL 備用液混合制成不含肝微粒體的對照。

2 結(jié) 果

2.1 辛弗林液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 空白豬尿基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍10～1 000 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5，線性關(guān)系良好。

2.1.2 回收率和變異系數(shù) 在0.1、0.5和1.0 μg·mL-13個添加濃度水平，豬尿中辛弗林的回收率為72.3%～95.0%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.5%～12.6%，批間變異系數(shù)為7.3%～13.8%。

2.2 CGIA檢測陽性樣品的辛弗林含量測定

當(dāng)PBS中辛弗林濃度為0.8 μg·mL-1時，β-受 體激動劑CGIA檢測仍呈陽性反應(yīng)(RAC陽性)，進(jìn)一步稀釋呈陰性；取多份 CGIA 檢測陰性的豬尿添加辛弗林標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含不同濃度的辛弗林添加豬尿，進(jìn)行 CGIA 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豬尿中辛弗林濃度為 0.2 μg·mL-1時，RAC仍呈陽性反應(yīng)，進(jìn)一步稀釋呈陰性。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析結(jié)果表明，飼喂了陳皮和青皮的豬尿液均檢出了辛弗林，平均濃度分別為1.36和1.65 μg·mL-1，飼喂厚樸、木瓜和紅景天的豬只尿液未檢出辛弗林。在陳皮和青皮的提取復(fù)溶液中，辛弗林的平均濃度分別為132.6 和312.7 μg·mL-1；而在厚樸、木瓜和紅景天3種中藥的提取復(fù)溶液中均未檢出辛弗林。

2.3 CGIA檢測陽性的中藥復(fù)溶液與小鼠肝微粒體的孵育結(jié)果

木瓜、厚樸復(fù)溶液和小鼠肝微粒體混合反應(yīng)后，0、1 h的CGIA檢測呈RAC陽性結(jié)果，2～6 h的CGIA檢測結(jié)果為RAC逐漸轉(zhuǎn)為陰性。陳皮、青皮復(fù)溶液和小鼠肝微粒體混合后，0～6 h 的CGIA檢測結(jié)果均呈RAC陽性。

陰性中藥木香和山藥的復(fù)溶液制備的辛弗林添加陽性樣品與小鼠肝微粒體混合反應(yīng)后，0～6 h的CGIA檢測結(jié)果均為RAC陽性。木香和山藥的復(fù)溶液經(jīng)肝微粒體孵育后，0～6 h的CGIA檢測均呈陰性。

對照試驗的結(jié)果：不含中藥對照試驗樣液0～6 h CGIA檢測均呈陰性；不含肝微粒體的假陽性中藥對照試驗樣液0～6 h的CGIA檢測均呈陽性。

紅景天的提取復(fù)溶液用雙蒸水稀釋5倍后即顯陰性，在體系中無法達(dá)到CGIA檢測靈敏度，未進(jìn)一步測試。

3 討 論

3.1 辛弗林引起的CGIA檢測β-受體激動劑假陽性

特異性單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點，并被廣泛應(yīng)用至膠體金免疫層析試紙條的制作上，試紙條檢測的特異性也依賴于單克隆抗體的識別[11]。試驗中使用的膠體金免疫層析檢測卡為專門檢測豬尿中CLE、RAC和SAL的試紙條，其在設(shè)計時可能是主要以豬尿為抗原和抗體的生理液基質(zhì)進(jìn)行開發(fā)，這可能是辛弗林在PBS緩沖液中和在豬尿中CGIA檢測靈敏度不同的原因。

辛弗林，又稱脫氧腎上腺素，是一種存在于陳皮、青皮等柑橘類植物果實的中藥成分，具有加速體內(nèi)脂肪氧化等作用，如圖1所示，其分子結(jié)構(gòu)與RAC較為接近，針對RAC的單克隆抗體可能會誤識別辛弗林為目標(biāo)抗原并與之結(jié)合，從而出現(xiàn)CGIA檢測β-受體激動劑假陽性的現(xiàn)象。

圖1 沙丁胺醇(a)、克倫特羅(b)、萊克多巴胺(c)、辛弗林(d)結(jié)構(gòu)式對比Fig.1 Structure comparison of salbutamol(a),clenbuterol(b),ractopamine(c)and synephrine(d)

試驗中，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，陳皮和青皮的提取復(fù)溶液以及飼喂豬收集的尿液均能檢出辛弗林，且濃度均高于CGIA的檢測低限，而木瓜、厚樸、紅景天的提取復(fù)溶液以及飼喂豬收集的尿液均未檢出辛弗林。試驗結(jié)果表明，中藥成分辛弗林能引起CGIA檢測RAC顯假陽性，而木瓜、厚樸、紅景天提取物中引起CGIA檢測β-受體激動劑顯假陽性的成分并非辛弗林，具體的成分確證仍需進(jìn)一步研究。

3.2 體外模型中小鼠肝微粒體對中藥CGIA檢測陽性成分代謝

與化學(xué)合成藥物不同，中藥的成分較多，與機(jī)體的相互作用較復(fù)雜[12]，同一種中藥，不同產(chǎn)地、生長時間等因素都會影響成分的變化。采用小鼠肝微粒體體外模型，可以研究動物機(jī)體的肝酶系統(tǒng)對藥物的代謝作用。陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥雖然直接提取CGIA檢測均呈陽性，但引起假陽性的成分可能不同。試驗中顯示，木瓜和厚樸的假陽性干擾成分能被小鼠肝微粒體代謝成非陽性物質(zhì)，提示該2種中藥的陽性成分可能在動物體內(nèi)被代謝，豬尿顯陰性；而紅景天的假陽性成分可能是濃度或活性較低，在豬尿中未達(dá)到有效檢測濃度。在木瓜、厚樸、紅景天3種中藥中，引起β-受體激動劑CGIA檢測的化學(xué)物質(zhì)鑒定有待進(jìn)一步探索；中藥成分辛弗林難以被小鼠肝微粒體代謝，提示陳皮和青皮中的辛弗林成分被動物吸收后在尿中形成較高濃度，導(dǎo)致CGIA檢測β-受體激動劑出現(xiàn)假陽性。

4 結(jié) 論

豬飼喂陳皮和青皮后引起豬尿CGIA檢測β-受體激動劑出現(xiàn)假陽性與陳皮和青皮中含有的中藥辛弗林成分有關(guān)。陳皮、青皮、厚樸、木瓜和紅景天5種中藥均含有CGIA檢測β-受體激動劑假陽性成分，但僅陳皮和青皮含有辛弗林。厚樸和木瓜的假陽性成分可被小鼠微粒體代謝消除，陳皮和青皮中含有的假陽性成分辛弗林難以被小鼠微粒體代謝消除。