張 萌，胡亞婕，曹 禹，甄 莉，劉 洋，徐 彬，楊玉英，李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，黑龍江省牛病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319)

近年來由于溫室效應(yīng)的產(chǎn)生導(dǎo)致全球氣候變暖，我國多個(gè)地區(qū)極端氣候頻發(fā)。2019年作為繼1951年來第5次高氣溫年份，導(dǎo)致全國大部分地區(qū)高溫日較往年顯著增多，北方地區(qū)全年氣溫上升明顯[1]，據(jù)目前研究顯示，我國高溫災(zāi)害的發(fā)生仍持續(xù)增長，氣溫的居高不下導(dǎo)致多地出現(xiàn)干旱、降水量大幅度降低等現(xiàn)象，造成農(nóng)作物受災(zāi)[2]。除此之外，持續(xù)的高溫天氣對(duì)我國畜牧業(yè)影響重大，不僅影響肉制品運(yùn)輸保存，當(dāng)外界環(huán)境溫度超過動(dòng)物所承受上限時(shí)還會(huì)誘發(fā)各類畜禽熱應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。熱應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生對(duì)動(dòng)物的腦[3]、消化吸收[4-5]、免疫功能[6]、繁殖功能[7]、血液生理生化指標(biāo)等都會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，嚴(yán)重的熱應(yīng)激反應(yīng)還會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。那么動(dòng)物在不同程度熱應(yīng)激反應(yīng)下又會(huì)有哪些具體的表現(xiàn)呢？熱應(yīng)激反應(yīng)下動(dòng)物機(jī)體又會(huì)產(chǎn)生哪些標(biāo)志性的行為以及生理學(xué)變化呢？基于此，作者選擇體況較為相近的雄性小鼠進(jìn)行不同時(shí)長的熱刺激，以其在曠場試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭懈鶕?jù)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間、距離及體征性行為作為評(píng)價(jià)熱應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性行為，以血液中激素水平變化規(guī)律判斷熱刺激對(duì)小鼠的具體影響。本研究選擇了曠場和高架十字迷宮兩種試驗(yàn)?zāi)Ｐ图癟M-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，對(duì)小鼠在接受不同時(shí)長熱刺激后自發(fā)運(yùn)動(dòng)行為的改變情況進(jìn)行監(jiān)測。曠場試驗(yàn)和高架十字迷宮都是國際公認(rèn)的典型的應(yīng)用于嚙齒動(dòng)物的焦慮測評(píng)裝置[8]。其原理是利用小鼠的好奇和恐懼心理使小鼠產(chǎn)生焦慮情緒，從而發(fā)生探究-規(guī)避行為[9]。此次試驗(yàn)根據(jù)小鼠熱刺激時(shí)長以及考慮小鼠自身承受承受能力，結(jié)合國內(nèi)外熱應(yīng)激模型構(gòu)建條件[10]，最終將熱刺激溫度定為34 ℃[11]。本試驗(yàn)旨在為熱應(yīng)激的初步診斷提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級(jí)ICR小鼠，8周齡，共40只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)試劑

5-羥色胺(5-HT)檢測試劑盒、皮質(zhì)酮(CORT)檢測試劑盒、促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)檢測試劑盒、多巴胺(DA)檢測試劑盒、腎上腺素(EPI)檢測試劑盒、去甲腎上腺素(NE)檢測試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

TM-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、OFT-100曠場試驗(yàn)箱、PMT-100高架十字迷宮等(成都泰盟軟件有限公司)、人工智能氣候室(濟(jì)南旭邦電子科技有限公司)、FM40-小型雪花制冰機(jī)(北京長流科學(xué)儀器有限公司)、SHP-250 恒溫培養(yǎng)箱(上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3.1 曠場試驗(yàn)裝置 本試驗(yàn)應(yīng)用的曠場試驗(yàn)裝置為25宮格尺寸：625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)。主要觀察指標(biāo)：小鼠在各區(qū)域運(yùn)動(dòng)、靜止的距離和時(shí)間。

1.3.2 高架十字迷宮裝置 本試驗(yàn)應(yīng)用高架十字迷宮裝置尺寸：各臂臂長300 mm，寬度60 mm，高架高度500 mm，開臂臂高6 mm，閉臂臂高150 mm。主要觀察指標(biāo)：小鼠在各區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、停留時(shí)間和進(jìn)入各區(qū)域次數(shù)。

圖1 曠場試驗(yàn)裝置Fig.1 Open-field test device

圖2 高架十字迷宮裝置Fig.2 Plus maze test device

1.4 試驗(yàn)程序

1.4.1 行為學(xué)測試 將ICR小鼠在人工智能氣候室中進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組，熱刺激2 h 組；熱刺激4 h 組和熱刺激6 h 組。待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，進(jìn)行同一溫度下不同時(shí)長熱刺激。熱刺激6 h組于上午8：00開始刺激；熱刺激4 h組于上午10：00開始刺激；熱刺激2 h組于中午12：00開始刺激。刺激結(jié)束后，于下午14：00-17：00對(duì)小鼠進(jìn)行曠場試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)。

圖3 試驗(yàn)方案Fig.3 Test scheme

TM-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)調(diào)試完畢后，將小鼠放入試驗(yàn)設(shè)備中央并保持小鼠背對(duì)試驗(yàn)人員。待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，開始記錄小鼠在各區(qū)域運(yùn)動(dòng)、靜止的距離和時(shí)間。所有的試驗(yàn)小鼠由同一試驗(yàn)人員放置，每只小鼠只進(jìn)行一次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)后徹底清除小鼠氣味防止影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性[12]。

TM-Vision行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)調(diào)試完畢后，將小鼠放入試驗(yàn)設(shè)備中央并保持小鼠面對(duì)開放臂方向，避免小鼠喜歡暗處試驗(yàn)過程中錯(cuò)過開放臂區(qū)域。待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，開始記錄小鼠在各區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離、停留時(shí)間和進(jìn)入各區(qū)域次數(shù)。所有的試驗(yàn)小鼠由同一試驗(yàn)人員放置，每只小鼠只進(jìn)行一次試驗(yàn)，每次試驗(yàn)后徹底清除小鼠氣味防止影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性[13-14]。

1.4.2 血液生理指標(biāo)測試 待不同時(shí)長熱刺激結(jié)束后，立即對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，采集血液后將其處死。血液樣本處理后利用試劑盒對(duì)小鼠血液生理指標(biāo)進(jìn)行檢測，其操作遵照試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 曠場試驗(yàn)

將曠場試驗(yàn)中小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的距離和時(shí)間作為評(píng)定不同時(shí)長熱應(yīng)激反應(yīng)下小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的參數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行分析。圖4(彩圖見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容，下同)顯示了不同時(shí)長熱刺激組小鼠在曠場中的活動(dòng)軌跡，直觀地展示出小鼠在各區(qū)域的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，所列圖片具有較好的普遍性和代表性。

圖4顯示與對(duì)照組相比，小鼠在進(jìn)行熱刺激2 h后在曠場中央?yún)^(qū)域活動(dòng)軌跡明顯增加；熱刺激4 h后小鼠在邊緣區(qū)域活動(dòng)增加；熱刺激6 h后小鼠在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)明顯降低，在角落區(qū)域活動(dòng)軌跡明顯增加。

圖4 曠場試驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡(彩圖見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù))Fig.4 Mouse activity trajectory map in Open Field Test (Please find the OSID data for the color figure)

在對(duì)曠場試驗(yàn)分析后結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃熱刺激 2 h(P<0.01)和 4 h(P<0.05)時(shí)移動(dòng)時(shí)間顯著增加(圖5A)；而移動(dòng)距離雖也表現(xiàn)出升高的趨勢，但無顯著性差異(圖5B)；而靜止時(shí)間則在刺激 2 h(P<0.01)、4 h(P<0.05)后顯著減少(圖5C)；小鼠在中心區(qū)域(圖5D)和邊緣區(qū)域(圖5F)停留時(shí)間逐漸減少，且時(shí)間依賴性展現(xiàn)出在角落停留時(shí)間增多，但變化不顯著(圖5E)。

2.2 高架十字迷宮

將高架十字迷宮試驗(yàn)中小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的距離、時(shí)間以及進(jìn)入各區(qū)域的次數(shù)作為評(píng)定不同時(shí)長-熱應(yīng)激反應(yīng)下小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)的參數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行分析。

圖6顯示了小鼠在經(jīng)歷不同時(shí)長熱刺激后在高架十字迷宮中的活動(dòng)軌跡，直觀地展示出小鼠在各區(qū)域的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，所列圖片具有較好的普遍性和代表性。圖6顯示，與對(duì)照組相比，小鼠在進(jìn)行熱刺激2 h后在高架十字迷宮開放臂和閉臂區(qū)域活動(dòng)軌跡明顯增多，熱刺激4 h后，小鼠頻繁停留于迷宮中心區(qū)域；熱刺激6 h后，小鼠活動(dòng)軌跡減少，并傾向于在閉臂區(qū)域活動(dòng)。

圖6 高架十字迷宮中小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡(彩圖見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù))Fig.6 Mouse activity trajectory map in Plus Maze Test (Please find the OSID data for the color figure)

結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃熱刺激下2 h(P<0.05)時(shí)在中心區(qū)域(圖7A)、開放臂區(qū)域(圖7B)和閉合臂區(qū)域(圖7C)移動(dòng)距離都顯著增加；而小鼠在開放臂區(qū)域停留時(shí)間呈時(shí)間依賴性增加，在熱刺激6 h(P<0.01)時(shí)變化顯著(圖7E)；小鼠進(jìn)入中心區(qū)域(圖7H)和開放臂區(qū)域(圖7I)的次數(shù)變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但無顯著性，34 ℃熱刺激下2 h (P<0.01)時(shí)小鼠進(jìn)入閉合臂區(qū)域的次數(shù)顯著增加(圖7 J)。

圖7 不同強(qiáng)度熱刺激對(duì)小鼠探索行為的影響Fig.7 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice

2.3 血液生理指標(biāo)

對(duì)小鼠進(jìn)行不同時(shí)長熱刺激后，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)血液中5-HT、DA、EPI、CORT、NE和CRH生理指標(biāo)進(jìn)行檢測，具體方法遵照試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃不同時(shí)長熱刺激下5-HT和DA無顯著變化(圖8A、B)；小鼠在熱刺激2 h(P<0.000 1)開始，血液中EPI、CORT含量極顯著上升，并具有時(shí)間依賴性(圖8C～D)；小鼠在熱刺激2 h(P<0.000 1)后血液中NE含量極顯著上升，熱刺激4 h(P<0.000 1)后達(dá)到峰值，但在熱刺激6 h(P<0.000 1)后稍有回落趨勢(圖8E)；小鼠在熱刺激4 h(P<0.001)時(shí)血液中CRH含量極顯著上升；熱刺激6 h(P<0.05)后稍有回落趨勢(圖8F)。

與對(duì)照組相比，*.P<0.05;**.P<0.01；NS.差異不顯著。圖7同Compared with control group,*.P<0.05;**.P<0.01;NS.The difference is insignificant.The same as Fig.7圖5 不同強(qiáng)度熱刺激對(duì)小鼠探索行為影響Fig.5 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice

3 討 論

針刺[15]、足底電擊[3]、束縛[16]、冷、熱刺激[17-18]等均為構(gòu)建分類小鼠應(yīng)激模型的常用方法。本試驗(yàn)在對(duì)小鼠進(jìn)行不同時(shí)長熱刺激后，通過曠場及高架十字迷宮裝置對(duì)小鼠行為學(xué)變化進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，結(jié)果表明，小鼠在熱刺激2 h后探索行為和自發(fā)運(yùn)動(dòng)顯著增加，而后伴隨刺激的時(shí)間增長逐漸降低。

大量研究表明，小鼠發(fā)生應(yīng)激后學(xué)習(xí)記憶力、認(rèn)知能力、探索行為等都會(huì)發(fā)生變化。在王衍等的研究中顯示慢性束縛應(yīng)激過后小鼠記憶力受損[19]；急性強(qiáng)迫大鼠游泳應(yīng)激后引發(fā)其焦慮恐懼心理導(dǎo)致行為呆滯[20]等，并且小鼠應(yīng)激后情緒、自主活動(dòng)[21-22]、修飾動(dòng)作、排泄次數(shù)[23-24]等都會(huì)發(fā)生改變。以上的研究結(jié)果似乎都顯示動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后機(jī)體功能會(huì)受到抑制。但是在本次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，雖然在熱刺激4、6 h后小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、距離等指標(biāo)均受到抑制，但這并不是全部變化。而數(shù)據(jù)中時(shí)間的變化趨勢雖然沒有運(yùn)動(dòng)距離變化明顯，但仍具有一致性，作者考慮這可能是由于監(jiān)測系統(tǒng)中分辨率對(duì)于動(dòng)作監(jiān)測過于靈敏的問題。

試驗(yàn)中,作者還觀察到小鼠在熱刺激2 h后自主運(yùn)動(dòng)和探索行為有顯著上升。通過查閱文獻(xiàn)，作者了解到這種結(jié)果是合理的。內(nèi)分泌學(xué)家Hans Selye很早就將應(yīng)激分為良性應(yīng)激和惡性應(yīng)激，又可以稱為生理性應(yīng)激和病理性應(yīng)激。良性應(yīng)激對(duì)身體有利甚至可以激發(fā)潛能，而惡性應(yīng)激對(duì)身體不利甚至?xí)斐蓳p傷。還有學(xué)者認(rèn)為探索行為作為動(dòng)物創(chuàng)新的一部分，屬于一種積極主動(dòng)的行為[25]，這也印證了小鼠探索行為的增加是應(yīng)激對(duì)機(jī)體的正面作用。嵇志紅等[26]對(duì)小鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激會(huì)增加小鼠空間、學(xué)習(xí)記憶能力，陳亞靜[14]也在試驗(yàn)中得出急性應(yīng)激可以顯著增加小鼠的探索行為和學(xué)習(xí)記憶力，并且不同年齡小鼠存在差異的結(jié)果。作者猜測出現(xiàn)這樣的結(jié)果是由于小鼠在低程度的刺激下形成了良性應(yīng)激，小鼠的情緒、身體素質(zhì)、學(xué)習(xí)能力等都得到了提升。其中不排除小鼠由于個(gè)體因素不受環(huán)境干擾或其他的個(gè)別情況。除此之外，試驗(yàn)中小鼠的性別[27]、年齡[28]、對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)程度[29]、進(jìn)行試驗(yàn)的次數(shù)[30]等都會(huì)成為造成試驗(yàn)結(jié)果不一致的原因。

機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，體內(nèi)的交感-腎上腺髓質(zhì)軸(SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)將會(huì)被激活，引起交感神經(jīng)活動(dòng)增加、兒茶酚胺類物質(zhì)及糖皮質(zhì)激素分泌增加從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究表明，機(jī)體發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)后，血液中CORT、CRH、EPI、NE水平將會(huì)有所變化。5-HT又稱為血清素，與多巴胺同樣作為存在于神經(jīng)中樞中重要的神經(jīng)遞質(zhì)[31]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體情緒、血糖水平、免疫功能、心血管功能等重要作用。選擇性5-HT 再攝取抑制劑(SSRI)近年來也作為抗抑郁藥物備受關(guān)注。

此次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠在接受不同時(shí)長熱刺激后，5-HT和DA并沒有發(fā)生顯著變化，而CORT、CRH、EPI、NE水平都在熱刺激后發(fā)生了顯著上調(diào)，并且NE和CRH水平在熱刺激6 h后稍有回落趨勢，這與作者的行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果趨勢相符。

與對(duì)照組相比，*.P<0.05;***.P<0.001；****.P<0.000 1;NS.差異不顯著Compared with control group,*.P<0.05;***.P<0.001；****.P<0.000 1;NS.The difference is insignificant圖8 不同強(qiáng)度熱刺激對(duì)小鼠血液生理指標(biāo)影響Fig.8 The effects of heat stimulation with different intensities on blood physiological indexes in mice

以上結(jié)果提示，或許并不能單純以急性應(yīng)激和慢性應(yīng)激將機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行簡單的分類和探討，因?yàn)閼?yīng)激的過程應(yīng)該是存在階段性變化的。通過對(duì)小鼠進(jìn)行不同程度的冷刺激和復(fù)溫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，小鼠在22 ℃冷刺激后探索行為增多，而伴隨刺激溫度的降低和時(shí)長的增加，小鼠自主運(yùn)動(dòng)和探索行為以及血液生理指標(biāo)都呈現(xiàn)了先升后降的趨勢[32-33]，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，本次通過高架十字迷宮試驗(yàn)和曠場試驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行同一溫度下不同時(shí)長熱刺激后的行為進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)合血液生理指標(biāo)進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)小鼠在熱應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后，自主運(yùn)動(dòng)和探索行為都發(fā)生了直觀改變，并希望此次發(fā)現(xiàn)可以為動(dòng)物熱應(yīng)激反應(yīng)的臨床診斷提供診斷基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

34 ℃熱刺激2 h對(duì)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)和探究行為有促進(jìn)作用，引起焦慮減少。但長時(shí)間熱刺激對(duì)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)和探究行為有抑制作用，導(dǎo)致焦慮樣行為增加，并提示機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控可能是小鼠熱刺激后情緒和行為異常的變化基礎(chǔ)。