張 萌，胡亞婕，曹 禹，甄 莉，劉 洋，徐 彬，楊玉英，李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，動物醫(yī)學基礎國家級實驗教學示范中心，黑龍江省牛病防治重點實驗室，大慶 163319)

近年來由于溫室效應的產(chǎn)生導致全球氣候變暖，我國多個地區(qū)極端氣候頻發(fā)。2019年作為繼1951年來第5次高氣溫年份，導致全國大部分地區(qū)高溫日較往年顯著增多，北方地區(qū)全年氣溫上升明顯[1]，據(jù)目前研究顯示，我國高溫災害的發(fā)生仍持續(xù)增長，氣溫的居高不下導致多地出現(xiàn)干旱、降水量大幅度降低等現(xiàn)象，造成農(nóng)作物受災[2]。除此之外，持續(xù)的高溫天氣對我國畜牧業(yè)影響重大，不僅影響肉制品運輸保存，當外界環(huán)境溫度超過動物所承受上限時還會誘發(fā)各類畜禽熱應激反應的發(fā)生。熱應激反應的發(fā)生對動物的腦[3]、消化吸收[4-5]、免疫功能[6]、繁殖功能[7]、血液生理生化指標等都會產(chǎn)生不同程度的影響，嚴重的熱應激反應還會導致動物死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。那么動物在不同程度熱應激反應下又會有哪些具體的表現(xiàn)呢？熱應激反應下動物機體又會產(chǎn)生哪些標志性的行為以及生理學變化呢？基于此，作者選擇體況較為相近的雄性小鼠進行不同時長的熱刺激，以其在曠場試驗和高架十字迷宮試驗模型中根據(jù)運動的時間、距離及體征性行為作為評價熱應激反應的標志性行為，以血液中激素水平變化規(guī)律判斷熱刺激對小鼠的具體影響。本研究選擇了曠場和高架十字迷宮兩種試驗模型及TM-Vision行為學試驗視頻分析系統(tǒng)，對小鼠在接受不同時長熱刺激后自發(fā)運動行為的改變情況進行監(jiān)測。曠場試驗和高架十字迷宮都是國際公認的典型的應用于嚙齒動物的焦慮測評裝置[8]。其原理是利用小鼠的好奇和恐懼心理使小鼠產(chǎn)生焦慮情緒，從而發(fā)生探究-規(guī)避行為[9]。此次試驗根據(jù)小鼠熱刺激時長以及考慮小鼠自身承受承受能力，結(jié)合國內(nèi)外熱應激模型構(gòu)建條件[10]，最終將熱刺激溫度定為34 ℃[11]。本試驗旨在為熱應激的初步診斷提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級ICR小鼠，8周齡，共40只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.2 試驗試劑

5-羥色胺(5-HT)檢測試劑盒、皮質(zhì)酮(CORT)檢測試劑盒、促腎上皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)檢測試劑盒、多巴胺(DA)檢測試劑盒、腎上腺素(EPI)檢測試劑盒、去甲腎上腺素(NE)檢測試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。

1.3 試驗儀器與設備

TM-Vision行為學試驗視頻分析系統(tǒng)、OFT-100曠場試驗箱、PMT-100高架十字迷宮等(成都泰盟軟件有限公司)、人工智能氣候室(濟南旭邦電子科技有限公司)、FM40-小型雪花制冰機(北京長流科學儀器有限公司)、SHP-250 恒溫培養(yǎng)箱(上海森信試驗儀器有限公司)。

1.3.1 曠場試驗裝置 本試驗應用的曠場試驗裝置為25宮格尺寸：625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)。主要觀察指標：小鼠在各區(qū)域運動、靜止的距離和時間。

1.3.2 高架十字迷宮裝置 本試驗應用高架十字迷宮裝置尺寸：各臂臂長300 mm，寬度60 mm，高架高度500 mm，開臂臂高6 mm，閉臂臂高150 mm。主要觀察指標：小鼠在各區(qū)域運動距離、停留時間和進入各區(qū)域次數(shù)。

圖1 曠場試驗裝置Fig.1 Open-field test device

圖2 高架十字迷宮裝置Fig.2 Plus maze test device

1.4 試驗程序

1.4.1 行為學測試 將ICR小鼠在人工智能氣候室中進行為期一周的適應性喂養(yǎng)后，隨機分為4組，每組10只，分別為對照組，熱刺激2 h 組；熱刺激4 h 組和熱刺激6 h 組。待小鼠適應環(huán)境后，進行同一溫度下不同時長熱刺激。熱刺激6 h組于上午8：00開始刺激；熱刺激4 h組于上午10：00開始刺激；熱刺激2 h組于中午12：00開始刺激。刺激結(jié)束后，于下午14：00-17：00對小鼠進行曠場試驗和高架十字迷宮試驗。

圖3 試驗方案Fig.3 Test scheme

TM-Vision行為學試驗視頻分析系統(tǒng)調(diào)試完畢后，將小鼠放入試驗設備中央并保持小鼠背對試驗人員。待小鼠適應環(huán)境后，開始記錄小鼠在各區(qū)域運動、靜止的距離和時間。所有的試驗小鼠由同一試驗人員放置，每只小鼠只進行一次試驗，每次試驗后徹底清除小鼠氣味防止影響試驗準確性[12]。

TM-Vision行為學試驗視頻分析系統(tǒng)調(diào)試完畢后，將小鼠放入試驗設備中央并保持小鼠面對開放臂方向，避免小鼠喜歡暗處試驗過程中錯過開放臂區(qū)域。待小鼠適應環(huán)境后，開始記錄小鼠在各區(qū)域運動距離、停留時間和進入各區(qū)域次數(shù)。所有的試驗小鼠由同一試驗人員放置，每只小鼠只進行一次試驗，每次試驗后徹底清除小鼠氣味防止影響試驗準確性[13-14]。

1.4.2 血液生理指標測試 待不同時長熱刺激結(jié)束后，立即對小鼠進行麻醉，采集血液后將其處死。血液樣本處理后利用試劑盒對小鼠血液生理指標進行檢測，其操作遵照試劑盒說明書。

2 結(jié) 果

2.1 曠場試驗

將曠場試驗中小鼠自發(fā)運動的距離和時間作為評定不同時長熱應激反應下小鼠自發(fā)運動的參數(shù)，并對其進行分析。圖4(彩圖見OSID開放科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容，下同)顯示了不同時長熱刺激組小鼠在曠場中的活動軌跡，直觀地展示出小鼠在各區(qū)域的運動狀態(tài)，所列圖片具有較好的普遍性和代表性。

圖4顯示與對照組相比，小鼠在進行熱刺激2 h后在曠場中央?yún)^(qū)域活動軌跡明顯增加；熱刺激4 h后小鼠在邊緣區(qū)域活動增加；熱刺激6 h后小鼠在中央?yún)^(qū)域活動明顯降低，在角落區(qū)域活動軌跡明顯增加。

圖4 曠場試驗小鼠運動軌跡(彩圖見OSID開放科學數(shù)據(jù))Fig.4 Mouse activity trajectory map in Open Field Test (Please find the OSID data for the color figure)

在對曠場試驗分析后結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃熱刺激 2 h(P<0.01)和 4 h(P<0.05)時移動時間顯著增加(圖5A)；而移動距離雖也表現(xiàn)出升高的趨勢，但無顯著性差異(圖5B)；而靜止時間則在刺激 2 h(P<0.01)、4 h(P<0.05)后顯著減少(圖5C)；小鼠在中心區(qū)域(圖5D)和邊緣區(qū)域(圖5F)停留時間逐漸減少，且時間依賴性展現(xiàn)出在角落停留時間增多，但變化不顯著(圖5E)。

2.2 高架十字迷宮

將高架十字迷宮試驗中小鼠自發(fā)運動的距離、時間以及進入各區(qū)域的次數(shù)作為評定不同時長-熱應激反應下小鼠自發(fā)運動的參數(shù)，并對其進行分析。

圖6顯示了小鼠在經(jīng)歷不同時長熱刺激后在高架十字迷宮中的活動軌跡，直觀地展示出小鼠在各區(qū)域的運動狀態(tài)，所列圖片具有較好的普遍性和代表性。圖6顯示，與對照組相比，小鼠在進行熱刺激2 h后在高架十字迷宮開放臂和閉臂區(qū)域活動軌跡明顯增多，熱刺激4 h后，小鼠頻繁停留于迷宮中心區(qū)域；熱刺激6 h后，小鼠活動軌跡減少，并傾向于在閉臂區(qū)域活動。

圖6 高架十字迷宮中小鼠運動軌跡(彩圖見OSID開放科學數(shù)據(jù))Fig.6 Mouse activity trajectory map in Plus Maze Test (Please find the OSID data for the color figure)

結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃熱刺激下2 h(P<0.05)時在中心區(qū)域(圖7A)、開放臂區(qū)域(圖7B)和閉合臂區(qū)域(圖7C)移動距離都顯著增加；而小鼠在開放臂區(qū)域停留時間呈時間依賴性增加，在熱刺激6 h(P<0.01)時變化顯著(圖7E)；小鼠進入中心區(qū)域(圖7H)和開放臂區(qū)域(圖7I)的次數(shù)變化呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但無顯著性，34 ℃熱刺激下2 h (P<0.01)時小鼠進入閉合臂區(qū)域的次數(shù)顯著增加(圖7 J)。

圖7 不同強度熱刺激對小鼠探索行為的影響Fig.7 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice

2.3 血液生理指標

對小鼠進行不同時長熱刺激后，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗對血液中5-HT、DA、EPI、CORT、NE和CRH生理指標進行檢測，具體方法遵照試劑盒說明書進行。

結(jié)果顯示，小鼠在34 ℃不同時長熱刺激下5-HT和DA無顯著變化(圖8A、B)；小鼠在熱刺激2 h(P<0.000 1)開始，血液中EPI、CORT含量極顯著上升，并具有時間依賴性(圖8C～D)；小鼠在熱刺激2 h(P<0.000 1)后血液中NE含量極顯著上升，熱刺激4 h(P<0.000 1)后達到峰值，但在熱刺激6 h(P<0.000 1)后稍有回落趨勢(圖8E)；小鼠在熱刺激4 h(P<0.001)時血液中CRH含量極顯著上升；熱刺激6 h(P<0.05)后稍有回落趨勢(圖8F)。

與對照組相比，*.P<0.05;**.P<0.01；NS.差異不顯著。圖7同Compared with control group,*.P<0.05;**.P<0.01;NS.The difference is insignificant.The same as Fig.7圖5 不同強度熱刺激對小鼠探索行為影響Fig.5 Effects of thermal stimulation of different intensities on exploratory behavior in mice

3 討 論

針刺[15]、足底電擊[3]、束縛[16]、冷、熱刺激[17-18]等均為構(gòu)建分類小鼠應激模型的常用方法。本試驗在對小鼠進行不同時長熱刺激后，通過曠場及高架十字迷宮裝置對小鼠行為學變化進行系統(tǒng)評估，結(jié)果表明，小鼠在熱刺激2 h后探索行為和自發(fā)運動顯著增加，而后伴隨刺激的時間增長逐漸降低。

大量研究表明，小鼠發(fā)生應激后學習記憶力、認知能力、探索行為等都會發(fā)生變化。在王衍等的研究中顯示慢性束縛應激過后小鼠記憶力受損[19]；急性強迫大鼠游泳應激后引發(fā)其焦慮恐懼心理導致行為呆滯[20]等，并且小鼠應激后情緒、自主活動[21-22]、修飾動作、排泄次數(shù)[23-24]等都會發(fā)生改變。以上的研究結(jié)果似乎都顯示動物應激反應發(fā)生后機體功能會受到抑制。但是在本次試驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，雖然在熱刺激4、6 h后小鼠的運動時間、距離等指標均受到抑制，但這并不是全部變化。而數(shù)據(jù)中時間的變化趨勢雖然沒有運動距離變化明顯，但仍具有一致性，作者考慮這可能是由于監(jiān)測系統(tǒng)中分辨率對于動作監(jiān)測過于靈敏的問題。

試驗中,作者還觀察到小鼠在熱刺激2 h后自主運動和探索行為有顯著上升。通過查閱文獻，作者了解到這種結(jié)果是合理的。內(nèi)分泌學家Hans Selye很早就將應激分為良性應激和惡性應激，又可以稱為生理性應激和病理性應激。良性應激對身體有利甚至可以激發(fā)潛能，而惡性應激對身體不利甚至會造成損傷。還有學者認為探索行為作為動物創(chuàng)新的一部分，屬于一種積極主動的行為[25]，這也印證了小鼠探索行為的增加是應激對機體的正面作用。嵇志紅等[26]對小鼠進行強迫游泳試驗，發(fā)現(xiàn)慢性應激會增加小鼠空間、學習記憶能力，陳亞靜[14]也在試驗中得出急性應激可以顯著增加小鼠的探索行為和學習記憶力，并且不同年齡小鼠存在差異的結(jié)果。作者猜測出現(xiàn)這樣的結(jié)果是由于小鼠在低程度的刺激下形成了良性應激，小鼠的情緒、身體素質(zhì)、學習能力等都得到了提升。其中不排除小鼠由于個體因素不受環(huán)境干擾或其他的個別情況。除此之外，試驗中小鼠的性別[27]、年齡[28]、對新環(huán)境的適應程度[29]、進行試驗的次數(shù)[30]等都會成為造成試驗結(jié)果不一致的原因。

機體的應激反應主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行調(diào)控，當機體受到外界刺激時，體內(nèi)的交感-腎上腺髓質(zhì)軸(SAM)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)將會被激活，引起交感神經(jīng)活動增加、兒茶酚胺類物質(zhì)及糖皮質(zhì)激素分泌增加從而維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究表明，機體發(fā)生熱應激反應后，血液中CORT、CRH、EPI、NE水平將會有所變化。5-HT又稱為血清素，與多巴胺同樣作為存在于神經(jīng)中樞中重要的神經(jīng)遞質(zhì)[31]，具有調(diào)節(jié)機體情緒、血糖水平、免疫功能、心血管功能等重要作用。選擇性5-HT 再攝取抑制劑(SSRI)近年來也作為抗抑郁藥物備受關注。

此次試驗中發(fā)現(xiàn)，小鼠在接受不同時長熱刺激后，5-HT和DA并沒有發(fā)生顯著變化，而CORT、CRH、EPI、NE水平都在熱刺激后發(fā)生了顯著上調(diào)，并且NE和CRH水平在熱刺激6 h后稍有回落趨勢，這與作者的行為學試驗結(jié)果趨勢相符。

與對照組相比，*.P<0.05;***.P<0.001；****.P<0.000 1;NS.差異不顯著Compared with control group,*.P<0.05;***.P<0.001；****.P<0.000 1;NS.The difference is insignificant圖8 不同強度熱刺激對小鼠血液生理指標影響Fig.8 The effects of heat stimulation with different intensities on blood physiological indexes in mice

以上結(jié)果提示，或許并不能單純以急性應激和慢性應激將機體的應激反應進行簡單的分類和探討，因為應激的過程應該是存在階段性變化的。通過對小鼠進行不同程度的冷刺激和復溫試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，小鼠在22 ℃冷刺激后探索行為增多，而伴隨刺激溫度的降低和時長的增加，小鼠自主運動和探索行為以及血液生理指標都呈現(xiàn)了先升后降的趨勢[32-33]，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，本次通過高架十字迷宮試驗和曠場試驗對小鼠進行同一溫度下不同時長熱刺激后的行為進行監(jiān)測，結(jié)合血液生理指標進行分析，最終發(fā)現(xiàn)小鼠在熱應激反應發(fā)生后，自主運動和探索行為都發(fā)生了直觀改變，并希望此次發(fā)現(xiàn)可以為動物熱應激反應的臨床診斷提供診斷基礎。

4 結(jié) 論

34 ℃熱刺激2 h對小鼠自發(fā)運動和探究行為有促進作用，引起焦慮減少。但長時間熱刺激對小鼠自發(fā)運動和探究行為有抑制作用，導致焦慮樣行為增加，并提示機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控可能是小鼠熱刺激后情緒和行為異常的變化基礎。