龐聰穎，喬 娜，陳漢明，馬欣艷，張 輝，潘家強，唐兆新，李 英

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

肉雞肺動高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)是由低溫、缺氧、生長過快、遺傳等多種因素單一或者共同作用下誘導(dǎo)的肉雞非傳染性營養(yǎng)代謝病，常見于生長較快的肉仔雞?，F(xiàn)代快速生長的肉禽品種對心力衰竭非常敏感，右心肥大衰竭是PHS肉雞死亡的重要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PHS肉雞心肌細胞內(nèi)Ca2+增加，心肌細胞發(fā)生水腫和肥大，顆粒變性、空泡變性甚至壞死[2-4]。心肌細胞Ca2+濃度增加導(dǎo)致細胞鈣穩(wěn)態(tài)被破壞，線粒體作為細胞內(nèi)鈣緩沖器，能吸收細胞內(nèi)增加的Ca2+，調(diào)節(jié)細胞鈣穩(wěn)態(tài)[5]。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)是位于線粒體內(nèi)膜上的跨膜蛋白，介導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+進入線粒體基質(zhì)。MCU過表達可使線粒體內(nèi)Ca2+濃度增加；MCU沉默使線粒體Ca2+濃度的增加被抑制[6]。其活性受到線粒體鈣攝取蛋白1(mitochondrial calcium uniporter 1，MICU1)的調(diào)節(jié)。MICU1作為MCU的門控蛋白，當細胞質(zhì)中Ca2 +濃度較低時，MICU1保持MCU處于關(guān)閉狀態(tài)，可減少胞漿中的Ca2+進入線粒體[7]。當細胞質(zhì)中Ca2+濃度較高時，MICU1作為MCU通道的協(xié)同激活劑，通過增加MCU的打開概率，增加激動劑誘發(fā)的線粒體Ca2 +濃度增加。線粒體鈣單一轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)劑1(mitochondrial cal-cium uniporter regulator 1，MCUR1)作為MCU的正調(diào)控因子，當其沉默時能抑制激動劑誘導(dǎo)的線粒體Ca2+攝取，并導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中Ca2+濃度顯著減少[8]。

心臟的收縮受心肌細胞內(nèi)Ca2+儲存和釋放過程調(diào)節(jié)[6]，細胞內(nèi)80%的Ca2+儲存于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。線粒體基質(zhì)中有大量Ca2+，線粒體產(chǎn)能的過程與線粒體Ca2+轉(zhuǎn)運的過程息息相關(guān)。線粒體內(nèi)Ca2+生理性的增加可激活線粒體脫氫酶，加速氧化代謝，促進ATP生成。但是，線粒體鈣超載導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放，進而導(dǎo)致線粒體去極化，膜電位下降和線粒體碎片化[9-10]。當細胞受損或受到刺激時，常伴有細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高[11]。過量游離Ca2+導(dǎo)致的鈣超載對細胞具有損傷作用，會引起細胞腫脹破裂，以及通過凋亡、自噬、壞死等路徑的細胞死亡[9]。線粒體作為細胞Ca2+超載的重要緩沖器，在細胞Ca2+超載中發(fā)揮著重要作用。RU360是一種細胞滲透性氧橋聯(lián)雙核釕胺絡(luò)合物，作用于MCU，特異性阻斷線粒體Ca2+攝取。線粒體通過MCU轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)Ca2+進入線粒體基質(zhì)，但MCU介導(dǎo)線粒體鈣轉(zhuǎn)運是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細胞線粒體損傷尚不明確。因此，本試驗旨在通過不同時間低氧處理肉雞心肌細胞，并使用RU360抑制MCU的表達，探究MCU是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細胞線粒體損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

817白羽肉雞雞胚購于山東德州忠言肉雞場，進行常規(guī)消毒和處理后，置于旋轉(zhuǎn)孵化箱中37.9 ℃和70%濕度條件下孵化至12胚齡。

1.2 主要試劑和儀器

活性氧試劑盒(S0033)購自南京建成生物工程有限公司；膜電位試劑盒(C2006)、Ripa裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光底物試劑盒購自上海天能技術(shù)有限公司；F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液、血清購自Gibco有限公司，F(xiàn)luo-4，Rhod-2，MCU(#14997)，MICU1(#12524)，MCUR1(#13706)抗體(動物來源：兔)均購自CST公司；TRIzol RNA提取試劑，購自大連寶生物工程有限公司；β-actin 抗體，購自北京銳抗生物技術(shù)有限公司；Prime Script Master Mix、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物技術(shù)股份有限公司公司。α-橫紋肌動蛋白(alpha sarcomeric Actin)單克隆抗體，購自美國Abcam公司；RU360，購自美國Sigma公司。

微量核酸測定儀購自Thermo Fisher科技公司；TDZ5-DZ5型冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；My Cycler Thermal型 mRNA擴增儀、Light Cycler408型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Unique-R10型超純水儀購自廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；GelView 6000 Pro全自動化學(xué)發(fā)光成像儀購自廣州博鷺騰儀器儀表有限公司；流式細胞儀購自美國貝克曼爾特有限公司。

1.3 雞原代心肌細胞提取培養(yǎng)與低氧處理

參照張曉輝[12]的方法進行，略作改動。試驗中所用器械、耗材等均經(jīng)過121 ℃、30 min高壓滅菌，操作過程中避免細菌污染。將孵化至12日齡的雞胚無菌操作取出心，浸泡于4 ℃預(yù)冷的PBS中。以相同操作取出其余雞胚的心。將心周圍多余脂肪和相連的血管去除，清除心組織內(nèi)的血液。將心組織剪碎，加入足量預(yù)熱的0.12%的Ⅱ型膠原酶，37 ℃水浴鍋中輕微震蕩消化8 min，加入等量含10% FBS培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，收集消化液。多次消化至心組織呈絮狀，用200目和400目細胞篩分別濾過消化液。消化液差速離心，重懸后心肌細胞接種于培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁30 min左右(利用成纖維細胞最先貼壁的特性，將心肌組織中的成纖維細胞去除)。收集差異貼壁后的細胞懸液，臺盼藍染色，用細胞計數(shù)板對肉雞心肌細胞懸液計數(shù)，調(diào)整密度至試驗需要。接種于細胞板，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待心肌細胞生長穩(wěn)定后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞處于對數(shù)生長期時，分為對照組(C)和試驗組(T)，對照組細胞培養(yǎng)條件37 ℃、21%O2；試驗組利用培養(yǎng)小室做低氧處理，培養(yǎng)條件為37 ℃、3%O2，處理時間分別為24、48和72 h，做心肌細胞損傷造模。在低氧培養(yǎng)72 h添加RU360預(yù)處理組，抑制MCU表達，進一步明確MCU是否參與低氧誘導(dǎo)的肉雞心肌細胞線粒體損傷。

1.4 心肌細胞鑒定

將細胞爬片置于24孔板孔內(nèi)，接種肉雞心肌細胞。生長穩(wěn)定后，先用PBS洗細胞，4%多聚甲醛固定細胞；0.2% Triton-100細胞打孔；3% H2O2處理15 min；10%馬血清，37 ℃，封閉1 h；加入α-SA抗體，4 ℃，過夜；1%BSA配制單抗鼠IgG，室溫反應(yīng)40 min；DAB染色2 min，用PBS終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染5 min，鹽酸分色3 s，氨水反藍5 min，干燥，中性樹脂封片，鏡檢。操作同任昊[13]和秦士貞[14]的方法。

1.5 ROS和膜電位測定

收集不同低氧時間處理的細胞，細胞染色和孵育具體操作詳見ROS和膜電位檢測試劑盒說明書。染色結(jié)束后流式細胞儀檢測。

1.6 細胞和線粒體內(nèi)鈣離子濃度變化的測定

Fluo-4 AM探針是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，用于檢測細胞內(nèi)的濃度。Fluo-4 AM在細胞外時幾乎不發(fā)光，當Fluo-4 AM進入細胞后被胞內(nèi)的酶剪切形成Fluo-4而滯留于細胞內(nèi)。Fluo-4可以和Ca2+結(jié)合，產(chǎn)生較強熒光，其信號強度與Ca2+濃度呈正相關(guān)。Rhod-2探針在結(jié)合Ca2+前基本不發(fā)熒光，熒光信號與Ca2+結(jié)合后明顯增強。其激發(fā)和發(fā)射光譜不會隨著細胞內(nèi)游離Ca2+變化發(fā)生明顯的遷移，其特異性適合檢測細胞和組織內(nèi)線粒體的Ca2+水平，其信號強度與Ca2+濃度呈正相關(guān)。將低氧處理24、48和72 h的細胞用預(yù)熱HBSS清洗3次后，依照試劑說明書進行染色操作，注意染液的配置和染色后細胞的洗滌均使用HBSS緩沖液。

1.7 qRT-PCR分析

qRT-PCR檢測MCU、MICU1和MCUR1的mRNA的相對表達水平。按照諾唯贊試劑盒說明書提取總RNA。使用Thermo Fisher科技公司的微量核酸測定儀檢測RNA的總濃度和純度。內(nèi)參 mRNA為β-actin。使用Primer 3.0軟件設(shè)計引物序列(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按說明書進行RNA反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進行qRT-PCR反應(yīng)。

表1 qRT-PCR使用的引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.8 Western blot分析

將不同低氧時間處理的細胞用含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液消化，提取總蛋白。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，將每個樣品稀釋至同一濃度，依照說明書操作，制備蛋白檢測樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩５攘康目偟鞍讟悠吩诖怪彪娪緝x上經(jīng)12.5%SDS-PAGE分離膠分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液常溫搖床封閉1 h，一抗4 ℃搖床孵育過夜。二抗孵育1 h，使用ECL發(fā)光液顯影，使用GelView6000 Pro全自動化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件進行灰度分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)運用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行分組方差分析比較，采用GraphPad Prism 6.0軟件進行作圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細胞的驗證

α-SA能標記心肌肌動蛋白，心肌細胞與α-SA發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，表達呈陽性。免疫組化染色后，可見圖1A是用PBS代替一抗的陰性對照，細胞胞漿未見棕黃色；圖1B的心肌細胞呈明顯的陽性著色，胞漿為棕黃色，細胞核接近圓形，心肌細胞呈三角形、梭形和不規(guī)則星形。非心肌細胞α-SA抗原表達為陰性，不會出現(xiàn)上述反應(yīng)，由此可以鑒定為心肌細胞。參照前人的方法[15]，隨機選取10個視野進行計數(shù)(心肌細胞純度=心肌細胞數(shù)/該視野細胞總數(shù)*100%)，心肌細胞純度約為93%。

A.對照處理;B.陽性結(jié)果A.Control treatment;B.Positive result圖1 免疫組化染色細胞爬片(400×)Fig.1 Immunohistochemical staining cell slide (400×)

2.2 線粒體功能狀態(tài)評價

由圖2可知，低氧處理24 h，試驗組線粒體膜電位上升，差異顯著(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗組與對照組相比ROS的產(chǎn)生增加，線粒體膜電位下降，差異極顯著(P<0.01)，說明線粒體發(fā)生損傷；低氧處理72 h時，RU360預(yù)處理組與試驗組相比，在RU360抑制MCU活性后，ROS的產(chǎn)生減少，線粒體膜電位上升，差異極顯著(P<0.01)。

A.DCF探針熒光強度分析，反映ROS產(chǎn)生的變化；B.JC-1探針熒光強度分析，反映線粒體膜電位變化A.Fluorescence intensity analysis of DCF probe,reflecting the changes of ROS production;B.Fluorescence intensity analysis of JC-1 probe,reflecting the changes of mitochondrial membrane potential圖2 線粒體功能評價Fig.2 Evaluation of mitochondrial function

2.3 細胞和線粒體鈣離子濃度變化

由圖3可知，低氧處理24和48 h，試驗組細胞內(nèi)游離Ca2+增多，差異顯著(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗組細胞內(nèi)游離Ca2+增多，差異極顯著(P<0.01)，低氧處理72 h時，RU360預(yù)處理組與試驗組相比，細胞內(nèi)游離Ca2+減少，差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度增加，抑制MCU的活性能減輕低氧誘導(dǎo)的細胞內(nèi)Ca2+增多。

a、b、c.分別常氧培養(yǎng)24、48、72 h的心肌細胞內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖;d、e、f.分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h心肌細胞內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖；g.低氧培養(yǎng)72 h且RU360預(yù)處理的心肌細胞線粒內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖；h.細胞內(nèi)Fluo-4探針熒光強度分析a,b and c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in the linemere of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of intracellular Fluo-4 probe圖3 心肌細胞鈣離子濃度檢測結(jié)果Fig.3 Determination results of calcium ion concentration in cardiomyocytes

由圖4可知，低氧處理24和72 h，試驗組線粒體內(nèi)游離Ca2+增多，差異顯著(P<0.05)，低氧處理72 h時，RU360預(yù)處理組與試驗組相比，線粒體內(nèi)游離Ca2+減少，差異極顯著(P<0.01)。說明低氧誘導(dǎo)了心肌細胞線粒體內(nèi)Ca2+濃度增加，抑制MCU活性能減輕低氧誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)Ca2+增多。

a、b、c.分別為常氧培養(yǎng)24、48、72 h的心肌細胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖;d、e、f.分別為低氧培養(yǎng)24、48、72 h心肌細胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖；g.低氧培養(yǎng)72 h且RU360預(yù)處理的心肌細胞線粒體內(nèi)游離Ca2+流式細胞儀分析圖；h.線粒體內(nèi)Rhod-2探針熒光強度分析a,b,c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of Rhod-2 probe in mitochondria圖4 線粒體鈣離子濃度檢測結(jié)果Fig.4 Calcium ion concentration detection result

2.4 MCU、MICU1、MCUR1 mRNA與蛋白表達水平

由圖5可知，低氧處理24 h，試驗組MCU、MICU1 mRNA的表達量顯著增加(P<0.05)；低氧處理48 h，試驗組MCUR1和MICU1 mRNA表達量顯著減少(P<0.05)；低氧處理72 h，試驗組MCUmRNA的表達量極顯著增加(P<0.01)。低氧72 h且RU360預(yù)處理組與低氧72 h組相比，MCUmRNA表達量極顯著降低(P<0.01)。

圖5 低氧處理心肌細胞MCU、MICU1、MCUR1 mRNA表達量Fig.5 mRNA expression levels of MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

由圖6可知，低氧處理24 h，試驗組MCU和MICU1蛋白的表達呈上調(diào)趨勢，差異不顯著(P>0.05)，MCUR1蛋白表達呈下調(diào)趨勢，差異不顯著(P>0.05)；低氧處理48 h，試驗組MCU和MICU1蛋白表達呈下調(diào)趨勢，差異不顯著(P>0.05)，MCUR1蛋白表達下調(diào)，差異顯著(P<0.01)；低氧處理72 h，試驗組MCU和MICU1蛋白表達呈上調(diào)趨勢，MCUR1蛋白表達呈下調(diào)趨勢，都差異不顯著(P>0.05)。

圖6 低氧處理心肌細胞鈣轉(zhuǎn)運蛋白MCU、MICU1、MCUR1相對表達Fig.6 Relative expression of calcium transporter MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

3 討 論

肉雞肺動脈高壓常見于生長迅速的肉雞，因其體型生長過快，導(dǎo)致臟器的生長發(fā)育無法滿足機體的消耗；機體代謝功能紊亂、Ca2+釋放增加、心肌細胞發(fā)生肥大及纖維化；心組織變形、腫大、質(zhì)地變?nèi)彳?；右心肥大擴張發(fā)生衰竭[3,16]。Ca2+刺激線粒體產(chǎn)生能量促進心收縮，也可觸發(fā)細胞死亡[17-18]。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)Ca2+參與不同酶系和各種類型細胞活動調(diào)節(jié)。細胞外Ca2+的內(nèi)流和細胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放是細胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加的主要途徑。胞內(nèi)Ca2+濃度的升高會使受體對Ca2+的敏感性提高，增強鈣離子通道的開放，促進胞內(nèi)Ca2+的釋放，進而誘發(fā)細胞外的Ca2+內(nèi)流，而過量Ca2+進入心肌細胞是低血氧時心組織發(fā)生病理變化的機制。線粒體作為細胞內(nèi)Ca2+過載的重要緩沖器，對細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著重要作用。MCU是位于線粒體內(nèi)膜上介導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+進入線粒體的重要蛋白，其活性受到MICU1和MCUR1的調(diào)控[6,19-20]。本研究通過適度低氧對原代肉雞心肌細胞進行肺動脈高壓的造模，探究MCU在心肌細胞損傷中的作用。細胞內(nèi)Ca2+來源于細胞外Ca2+的進入和細胞器Ca2+的釋放，當細胞內(nèi)Ca2+達到一定濃度時，細胞內(nèi)Ca2+反過來抑制細胞器Ca2+的釋放，從而保證細胞內(nèi)Ca2+的數(shù)量可以觸發(fā)生理功能，又不會損傷細胞[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)肉雞心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)增加，與前人的研究結(jié)果一致[22]。細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高會觸發(fā)細胞的鈣緩沖機制，包括促進細胞器對細胞內(nèi)Ca2+的稀釋，而線粒體對Ca2+吸收作用在其中扮演重要角色。本試驗發(fā)現(xiàn)，低氧處理肉雞心肌細胞后，線粒體內(nèi)Ca2+濃度在24和72 h時，顯著升高。除此之外，心肌細胞內(nèi)MCU的轉(zhuǎn)錄水平與心肌細胞內(nèi)線粒體Ca2+濃度變化一致。因此，低氧導(dǎo)致的細胞線粒體Ca2+濃度變化可能與MCU的表達水平變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MCU在低氧處理心肌細胞的過程中，表達先增加后降低再增加的趨勢符合線粒體內(nèi)Ca2+濃度變化趨勢，提示MCU介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)細胞內(nèi)增加的Ca2+進入線粒體。線粒體內(nèi)適當?shù)腃a2+提升，促進線粒體的呼吸功能，但持續(xù)的線粒體鈣超載，會導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧生成增加，膜電位降低，引發(fā)線粒體發(fā)生損傷。有研究顯示，氧化應(yīng)激信號促進MCU氧化并增加其通道活性，在氯化鈷化學(xué)缺氧開始階段，MCU介導(dǎo)線粒體Ca2+攝取導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，活性氧正反饋作用氧化修飾MCU復(fù)合物，線粒體持續(xù)性Ca2+超載和活性氧積累，過量的活性氧將對細胞組分造成嚴重損傷，甚至造成細胞死亡[23-25]，并導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。隨著線粒體鈣離子濃度增加，可導(dǎo)致mPTP孔開放，線粒體會因為基質(zhì)的高滲透壓而迅速吸水膨脹導(dǎo)致線粒體外膜破裂，失去對離子流動的選擇性引起線粒體膜電位崩潰，ATP生成減少，最終導(dǎo)致細胞死亡[26]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化多種心肌肥厚相關(guān)基因，其中MCUmRNA過表達導(dǎo)致肌肉細胞肥大已有證明[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧處理早期，MCU介導(dǎo)游離Ca2+進入線粒體，激活線粒體脫氫酶，加快線粒體有氧代謝，膜電位升高；隨著低氧處理時間延長，低氧組線粒體膜電位降低，這與Giacomello等[28]的研究發(fā)現(xiàn)一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與單獨低氧處理組相比，RU360與低氧聯(lián)合處理組中細胞和線粒體內(nèi)Ca2+濃度下降，ROS下降，線粒體膜電位上升。說明抑制低氧誘導(dǎo)的MCU過表達可以減輕線粒體鈣超載，保護線粒體功能。

4 結(jié) 論

本研究表明,低氧誘導(dǎo)心肌細胞MCU及其相關(guān)基因和蛋白異常表達，導(dǎo)致線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體功能下降；抑制MCU表達可以減輕低氧誘導(dǎo)的心肌細胞線粒體鈣超載，保護線粒體功能。