向 益，張 樺，王 利*，魏 勇，俄木曲者

(1.西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室，成都 610041；2.西南民族大學 動物科學國家民委重點實驗室，成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院，成都 610066)

肝是機體重要的代謝和解毒器官。生物性和物理性等因素均可造成肝損傷。四氯化碳可引起大鼠肝纖維化[1]。對乙酰氨基酚可引起小鼠藥物性肝損傷[2]。白酒可引起小鼠酒精性肝損傷[3]。飼喂蛋氨酸膽堿缺乏飼料可引起小鼠非酒精性脂肪性肝損傷[4]。飼喂含鎘飼料可引起仔豬肝毒性損傷[5]。脂多糖可引起小鼠膿毒癥[6]。乙型肝炎病毒可引起大鼠病毒性肝炎[7]。土曲霉是一種機會性致病菌，可引起人和動物肝損傷，如兒童肝炎、小鼠脂肪肝和大鼠肝纖維化，但其損傷機制尚不清楚[8-10]。

鐵死亡(ferroptosis)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞死亡方式，其特征是鐵依賴性的，細胞內活性氧堆積的非細胞凋亡形式的細胞死亡[11]。當誘導劑作用于肝癌、肺癌和卵巢癌細胞后，癌細胞的增殖通過鐵死亡方式被抑制[12-14]。此外，鐵死亡與伴隨脂質過氧化的非惡性細胞損傷的發(fā)病機制也密切相關。鐵死亡可發(fā)生于丙型肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝損傷和血色沉著病[11]。這些肝損傷類型均與鐵代謝失衡以及活性氧增多誘導的脂質過氧化有關[15]。本研究用土曲霉MSF2菌株孢子懸液注射小鼠，觀察肝氧化損傷相關指標、組織病理學和鐵死亡相關基因mRNA轉錄水平的變化，揭示該菌株引起小鼠肝損傷的分子機制。這為進一步探究土曲霉的致病機制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

土曲霉MSF2菌株分離自四川某羊場發(fā)病羊肝，由本課題組鑒定并保種于西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室。

1.2 試驗材料

20只昆明小鼠，體重為(18±2)g，雌雄各半，購自四川省成都市中醫(yī)藥研究所。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和鐵離子檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司；普魯士藍染色試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 實驗動物分組及處理

采用三點接種法將保種的土曲霉MSF2菌株無菌接種于PDA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)5 d，制備孢子懸液，用血球計數(shù)法將濃度調整為5×107CFU·mL-1[16]。20只 昆明小鼠經(jīng)適應性飼喂3 d后，隨機分為對照組和試驗組，每組10只，試驗組腹腔注射0.3 mL孢子懸液，對照組注射等量生理鹽水，試驗周期為7 d。試驗結束后采集小鼠肝分別保存于4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和-80 ℃冰箱備用。

1.4 小鼠肝氧化損傷指標及鐵離子含量檢測

取對照組和試驗組小鼠肝0.2 g于50 mL管中，加入9倍體積生理鹽水，用超聲波破碎儀在400 A，5 s·次-1，間隔10 s反復5次條件下破碎，制成10%組織勻漿。按照試劑盒說明書檢測肝MDA含量、GSH含量、GSH-PX活力、T-SOD活力及鐵離子含量。

1.5 小鼠肝組織切片制作及HE染色

取出保存于4%多聚甲醛的肝，流水沖洗24 h后，于不同濃度乙醇中逐級脫水1 h，二甲苯透明25 min 后，進行浸蠟與包埋。切片后，脫蠟至水，常規(guī)蘇木素、伊紅染色，中性樹膠封片，用光學顯微鏡觀察其病理變化。

1.6 小鼠肝普魯士藍染色

將制備的小鼠肝組織切片脫蠟至水，用普魯士藍工作液染色30 min，伊紅復染10 s，90%乙醇、95%乙醇和100%乙醇各脫水2 min，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，用光學顯微鏡觀察結果。

1.7 小鼠肝透射電鏡切片制作

將保存于2.5%戊二醛的小鼠肝取出，用1% 鋨酸固定2 h，在4 ℃條件下，不同濃度乙醇中逐級脫水10 min。室溫包埋與切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，用透射電子顯微鏡觀察肝細胞結構變化。

1.8 Real-PCR檢測鐵死亡相關基因mRNA轉錄水平

按照試劑盒說明書提取小鼠肝總RNA，反轉錄為cDNA，于-20 ℃保存。檢測各組小鼠肝TFR1、DMT1、FTH1、GPX4、SLC7A11、VDAC3基因mRNA轉錄水平(引物序列見表1)。反應程序：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃變性10 s，退火10 s(溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣本重復3次，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，計算各基因mRNA相對轉錄水平。

表1 鐵死亡相關基因引物序列Table 1 Primer sequences of ferroptosis related gene

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，利用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Graphpad 5.0軟件制圖。

2 結 果

2.1 小鼠肝氧化損傷指標的變化

用MDA、GSH、GSH-PX、T-SOD試劑盒檢測小鼠肝各指標。結果表明，與對照組相比，試驗組小鼠肝中MDA含量極顯著升高(P<0.01)，GSH含量、GSH-PX活力和T-SOD活力極顯著降低(P<0.01)，詳見圖1。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝發(fā)生了氧化損傷。

A.丙二醛含量；B.谷胱甘肽含量；C.谷胱甘肽過氧化物酶活力；D.總超氧化物歧化酶活力。*表示對照組與試驗組相比差異顯著(P<0.05)；**表示對照組與試驗組相比差異極顯著(P<0.01)。下同A.MDA content；B.GSH content；C.GSH-PX activity；D.T-SOD activity.*indicates a significant difference between the control group and the test group (P<0.05);** indicates that the difference between the control group and the test group is extremely significant (P<0.01).The same as below圖1 小鼠肝氧化損傷指標的變化Fig.1 The change of oxidative damage indexes in mice liver

2.2 小鼠肝鐵離子含量的變化

用鐵檢測試劑盒檢測小鼠肝鐵離子含量。結果表明，試驗組小鼠肝中的鐵離子含量極顯著高于對照組(P<0.01)，詳見圖2。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝鐵離子代謝紊亂。

圖2 小鼠肝鐵離子含量變化Fig.2 The change of iron ions content in mice liver

2.3 小鼠肝組織病理學變化

肝組織病理切片經(jīng)HE染色后，用光學顯微鏡觀察其病理變化。結果表明，對照組小鼠肝細胞清晰，核大小均一、呈圓形(圖3A)；試驗組小鼠肝中央靜脈充滿大量紅細胞，肝細胞腫脹，炎性細胞浸潤，以淋巴細胞、巨噬細胞為主，少量肝細胞腫脹、壞死，溶解(圖3B)。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝出現(xiàn)病理損傷。

A.對照組小鼠肝細胞清晰，未見明顯病理變化；B.試驗組小鼠肝細胞腫脹、壞死(黑色箭頭)，淋巴細胞(紅色箭頭)，巨噬細胞(藍色箭頭)浸潤A.The hepatocytes of mice in the control group were clear and had no pathological changes;B.The hepatocytes of mice in the test group were swollen and necrotic (black arrow),lymphocytes (red arrow)and macrophages (blue arrow)were infiltrated圖3 小鼠肝組織病理變化(400×)Fig.3 The change of histopathologic in mice liver (400×)

2.4 小鼠肝普魯士藍染色

小鼠肝切片經(jīng)普魯士藍染色后，用光學顯微鏡觀察結果。結果表明，對照組小鼠肝細胞未見被染成藍色的鐵離子沉積，鐵染色結果呈陰性(圖4A)，試驗組小鼠肝細胞中可見藍色深染的鐵離子沉積(圖4B)。

A.對照組小鼠肝細胞鐵染色陰性；B.試驗組小鼠肝細胞可見鐵離子沉積(黑色箭頭)A.Iron stain was negative in the control group of mice hepatocytes；B.Iron ions accumulated in the test group of mice hepatocytes (black arrow)圖4 小鼠肝普魯士藍染色結果(400×)Fig.4 Results of Perls stain in mice liver (400×)

2.5 小鼠肝超微結構變化

制備肝超微病理切片后，用透射電鏡觀察其超均勻，胞核規(guī)則，核內常染色質分布，線粒體大多呈圓形且結構完整,電子密度均勻,可見線粒體嵴微結構變化。結果表明，對照組小鼠肝細胞質分布(圖5A)；試驗組小鼠肝細胞質內線粒體變小、數(shù)量增多，線粒體嵴減少甚至消失，膜密度增加，染色變深(圖5B)。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝發(fā)生了鐵死亡。

A.對照組肝細胞內線粒體完整呈圓形，電子密度均勻，可見細管狀嵴；B.試驗組肝細胞線粒體變小、數(shù)量增多，線粒體嵴減少甚至消失，膜密度增加，染色變深。Mit.線粒體；rER.粗面內質網(wǎng)；RI.核糖體A.The mitochondria in the hepatocytes of the control group were complete and round,with uniform electron density and fine tubular cristae;B.In the test group,the mitochondria of hepatocytes became smaller and more numerous,the mitochondrial cristae decreased or even disappeared,the membrane density increased,and the staining became darker.Mit.Mitochondria;rER.Rough endoplasmic reticulum;RI.Ribosome圖5 小鼠肝超微結構變化(15 000×)Fig.5 The change of ultrastructure in mice liver (15 000×)

2.6 小鼠肝鐵死亡相關基因mRNA轉錄水平的變化

qPCR檢測鐵死亡相關基因mRNA轉錄水平。結果表明，與對照組相比，試驗組小鼠肝中TFR1、DMT1、FTH1 基因mRNA相對轉錄水平極顯著升高(P<0.01)，GPX4 基因mRNA相對轉錄水平極顯著降低(P<0.01)；SLC7A11 基因mRNA 相對轉錄水平顯著降低(P<0.05)；VDAC3 基因mRNA相對轉錄水平顯著升高(P<0.05)，詳見圖6。

圖6 小鼠肝鐵死亡相關基因mRNA相對轉錄水平Fig.6 Relative mRNA transcription level of ferroptosis related genes of mice liver

3 討 論

土曲霉是一種機會性病原菌，易感染患有惡性腫瘤、接受同種異體造血干細胞移植或實體器官移植的患者，引起播散性真菌病。當人或動物感染土曲霉后，導致肝嚴重損傷。Trachana等[8]報道患免疫缺陷的兒童感染土曲霉后引發(fā)肝炎，活檢發(fā)現(xiàn)肝細胞變性、壞死，淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤。Slesion等[9]報道土曲霉可引起小鼠持久性、亞臨床性肝損傷，組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)肝細胞脂肪變性，并伴有炎性細胞浸潤。Sharma等[10]報道土曲霉感染可引起大鼠肝纖維化，組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)肝小葉周圍纖維增生，細胞壞死、空泡化明顯，并伴有單核細胞浸潤。Day和Penhale[17]報道土曲霉感染可引起犬肝損傷，組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)霉菌菌絲出現(xiàn)在肝細胞間，肝細胞壞死，并伴有炎性細胞浸潤。本研究中土曲霉MSF2菌株也引起小鼠急性肝炎，病理變化與上述報道基本一致。損傷程度的差異可能由菌株來源或毒力強弱不同導致。

鐵死亡的特征是鐵離子過載和毒性脂質過氧化物堆積，所以可通過氧化損傷相關指標以及鐵死亡相關基因mRNA轉錄水平判定是否發(fā)生鐵死亡。MDA是自由基發(fā)生過氧化反應的終產(chǎn)物。GSH、GSH-PX能將有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物，維持機體氧化與抗氧化平衡。SOD能清除對機體有害的超氧陰離子自由基，是機體內重要的抗氧化酶[18-19]。這些指標的變化可反映機體氧化損傷程度。TFR1、DMT1、FTH1控制著鐵離子的攝取與儲存，對維持細胞內鐵穩(wěn)態(tài)有著重要作用。鐵穩(wěn)態(tài)被破壞后，細胞內游離鐵含量增加通過Fenton反應促進脂質活性氧的產(chǎn)生，促進鐵死亡的發(fā)生。GPX4表達降低導致GSH含量下降，大量活性氧產(chǎn)生，導致鐵死亡發(fā)生。SLC7A11調控胱氨酸的攝取，胱氨酸可合成GSH，SLC7A11表達減少，加劇氧化損傷并促進鐵死亡發(fā)生。VDAC3是細胞內代謝物分子進出線粒體的必經(jīng)通道，VDAC3表達增加會促進鐵死亡發(fā)生[20-22]。這些基因的變化與鐵死亡密切相關。

鐵死亡可見于各種類型的疾病模型中。Yang等[23]報道高脂飲食可引起小鼠非酒精性脂肪性肝炎，模型組小鼠肝氧化損傷程度增加，MDA含量升高，SOD活力和GSH-PX活力降低，鐵離子含量升高，TFR1表達升高，F(xiàn)TH1和GPX4表達降低。李安培[24]報道六價鉻可引起大鼠腎損傷，模型組大鼠腎鐵離子含量升高，GPX4表達降低，TFR1表達升高。晏思源[25]報道葡萄糖腹膜透析液可引起大鼠腹膜纖維化，模型組GPX4和SLC7A11表達降低。Chen等[26]報道葡聚糖硫酸鈉(DSS)可引起小鼠潰瘍性結腸炎，模型組小鼠結腸組織鐵離子含量升高，MDA含量升高，GPX4和FTH1表達降低。何信用等[27]報道高脂飲食可引起小鼠動脈粥樣硬化，模型組小鼠動脈SOD活力、GSH含量降低，MDA含量升高，F(xiàn)TH1、GPX4和SLC7A11表達降低。Liu等[28]使用鐵死亡激活劑(erastin)在神經(jīng)細胞中構建鐵中毒模型，細胞中鐵離子含量升高，MDA含量升高，GSH含量降低，TFR1、FTH1和VDAC3表達升高，GPX4和SLC7A11表達降低。Xu等[29]采用DSS構建小鼠結腸炎模型，模型組MDA含量升高，組織鐵離子含量升高，GPX4表達降低，F(xiàn)TH1表達升高。本研究結果與上述研究結果基本一致。在本研究中，F(xiàn)TH1基因mRNA相對轉錄水平顯著升高，這是由于鐵代謝失衡初期，細胞內游離鐵離子含量升高，鐵蛋白儲存能力增加，導致FTH1轉錄水平升高。此外，本研究用透射電鏡觀察了肝細胞超微變化，發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠肝細胞具有顯著的鐵死亡特征——線粒體萎縮、嵴減少以及膜密度增加[18]。

4 結 論

土曲霉MSF2菌株可引起小鼠肝MDA含量升高，GSH含量、GSH-PX活力和T-SOD活力降低，肝氧化水平升高，鐵離子含量升高，線粒體萎縮、嵴減少和膜密度增加，TFR1、DMT1、FTH1和VDAC3基因 mRNA轉錄水平升高，GPX4和SLC7A11基因 mRNA轉錄水平降低。土曲霉MSF2菌株可引起小鼠肝發(fā)生鐵死亡。