陳芳芳，桂亞萍，于鳳梅，張 俊，談 陽，李錦春，劉翠艷，查麗莎

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子與應(yīng)用免疫創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，合肥 230036)

恒定鏈(invariant chain,Ii)是一種非多態(tài)的Ⅱ型跨膜蛋白。Ii參與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子的裝配、成熟和轉(zhuǎn)運(yùn)，在內(nèi)吞體中協(xié)助MHC Ⅱ類分子進(jìn)行抗原肽加工和提呈；后來發(fā)現(xiàn)，Ii還可以協(xié)助MHC Ⅰ類分子對(duì)抗原肽的轉(zhuǎn)運(yùn)，即Ii參與了抗原的交叉遞呈[1-3]。Ii還是適應(yīng)性免疫的多功能調(diào)節(jié)器，如負(fù)責(zé)將MHCⅠ類和Ⅱ類分子以及其他Ii相關(guān)分子(如Fc受體)分選進(jìn)入特定的內(nèi)吞體途徑和調(diào)節(jié)B細(xì)胞的發(fā)育和成熟等[3-6]。Ii的活性片段可攜帶抗原肽在細(xì)胞內(nèi)吞體中分別與MHCⅠ類和Ⅱ類分子共定位和結(jié)合，參與抗原遞呈，這個(gè)特性使Ii活性片段作為疫苗載體可以直接進(jìn)入內(nèi)吞體途徑，易化抗原在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。所以，以Ii為載體的疫苗得到廣泛應(yīng)用[8-9]。此外，Ii還是一些細(xì)胞因子和病毒的受體[10-13]。這些功能的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用均與Ii在細(xì)胞中的定位有關(guān)，尤其是在內(nèi)吞體中的定位。當(dāng)Ii表達(dá)時(shí)，內(nèi)吞體的成熟和蛋白酶降解被延遲，在一些非抗原提呈細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)吞體增大，其機(jī)制與內(nèi)吞體中SNARE[soluble N-ethylmaleimide sensitive-factor(NSF)attachment protein (SNAP)receptor]蛋白的Vti1b有關(guān)[14]。

Rab是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要家族，它們分布于真核細(xì)胞所有與漿膜相關(guān)的細(xì)胞器(如細(xì)胞核、高爾基體和內(nèi)吞體等)，在細(xì)胞器間轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白過程中起重要作用，其中，Rab5a是介導(dǎo)細(xì)胞吞噬過程的必要調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)抗原及抗原遞呈分子的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)其影響MHC Ⅱ類分子對(duì)抗原肽的遞呈，應(yīng)用辛伐他汀可以抑制這種作用[15-17]。Rab7b在哺乳動(dòng)物中主要定位于晚期內(nèi)吞體、溶酶體和高爾基體。其不僅參與胞內(nèi)活性蛋白從早期內(nèi)吞體到晚期內(nèi)吞體/溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且還是內(nèi)吞體到高爾基體或/和跨高爾基體系統(tǒng)(trans-Golgi network,TGN)的重要調(diào)節(jié)蛋白[18-19]。

課題組此前發(fā)現(xiàn)雞Ii可以分別與Rab5a和Rab7b結(jié)合，并在細(xì)胞內(nèi)與之共定位[20-21]。但是并不清楚在Ii的多個(gè)結(jié)構(gòu)域中與Rab分子結(jié)合以及在細(xì)胞定位中的作用。為此，本研究構(gòu)建了Ii的不同結(jié)構(gòu)域片段以及Ii突變體，探明它們與Rab5a和Rab7b結(jié)合和共定位的特性，以進(jìn)一步解析Ii在免疫反應(yīng)中細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

PCR plus mix、DNA Marker DL2000、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶和蛋白Marker購(gòu)自東盛生物(廣州)有限公司；T4連接酶購(gòu)自東洋紡(日本)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑lipo8000購(gòu)自碧云天(上海)有限公司；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自康為世紀(jì)(北京)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone(美國(guó))有限公司；鎳柱、Gluttathione Sepharose 4B柱和電化學(xué)發(fā)光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自GE(瑞士)有限公司；小鼠抗GFP、RFP、His抗體和酶標(biāo)記山羊抗鼠抗體購(gòu)自中杉金橋(北京)有限公司；重組質(zhì)粒pmCherry-C1、pEGFP-C1、pEGFP-C1-cIi、pGEX-4T-1、pET-32a-cIi、pGEX-4T-1-cRab5a、pGEX-4T-1-cRab7b、pmCherry-C1-cRab5a、pmCherry-C1-cRab7b、人胚胎腎細(xì)胞系293 T細(xì)胞和大腸桿菌(E.coli)Rostta(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 Ii功能域和Ii突變體基因的擴(kuò)增

用自行設(shè)計(jì)的引物，以實(shí)驗(yàn)室保存的含有cIi質(zhì)粒為模板，分別克隆含Ii胞漿區(qū)和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域的cIi(Cyt-Tra)和含構(gòu)成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)的CLIP和三聚體區(qū)的cIi(CLIP-TRIM)；同時(shí)，應(yīng)用重疊延伸PCR法獲得3個(gè)Ii突變體cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M81-99aa)，突變范圍在CLIP片段內(nèi)，分別為突變CLIP的81-87位(M81-87aa)、91-99位(M91-99aa)和81-99位(M81-99aa)氨基酸。PCR和重疊延伸方法參照陳芳芳等[21]。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用雙酶切方法分別將上述克隆的5個(gè)基因片段定向插入真核和原核表達(dá)載體pEGFP-C1和pET-32a中，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，分別構(gòu)建含6個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒和6個(gè)原核質(zhì)粒的重組菌Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M81-99aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(Cyt-Tra)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(CLIP-TRIM)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(Cyt-Tra)和Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(CLIP-TRIM)以及對(duì)照的空載體Rosetta(DE3)pET-32a。構(gòu)建的重組菌經(jīng)PCR和酶切初步鑒定后送擎科(南京)生物公司測(cè)序。質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定的方法同陳芳芳等[21]。本研究中所用引物、基因序列和構(gòu)建的重組質(zhì)粒名稱見表1。

1.4 真核轉(zhuǎn)染和激光共聚焦觀察

將構(gòu)建的含有綠色熒光的重組質(zhì)粒與本實(shí)驗(yàn)室保存的帶有紅色熒光的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-cRab5a和pmCherry-C1-cRab7b分別共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用PBS清洗。4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次后封片，在LSM 880 with Airyscan激光共聚焦顯微鏡觀察真核重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)的共定位。同時(shí)為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，應(yīng)用Western blot進(jìn)行蛋白的特異性鑒定。細(xì)胞轉(zhuǎn)染、觀察和鑒定的方法同陳芳芳等[21]。

1.5 原核重組菌的蛋白表達(dá)與鑒定

將上述經(jīng)鑒定正確的原核重組表達(dá)菌和本實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7b、Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab5a和Rosetta(DE3)pGEX-4T-1進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化和鑒定。重組菌用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)0.5 mmol·L-1，16 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)24 h。離心收集的菌體用180 W，5 s，間隔10 s超聲波破碎菌體，12 000g離心15 min，上清中的蛋白用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行電泳和染色觀察。His和GST標(biāo)簽的蛋白分別用鎳柱和GST親和層析柱(glutathione sepharose 4B)進(jìn)行純化，純化后蛋白用SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。

1.6 拉下法(Pull-down)檢測(cè)目的蛋白間的結(jié)合

將帶有GST標(biāo)簽蛋白的GST/cRab5a、GST/cRab7b、GST蛋白分別加入GST親和層析柱內(nèi)作為錨定蛋白，放入4 ℃冰箱內(nèi)平衡30 min左右，將攜帶His標(biāo)簽的蛋白His/cIi、His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)、His/cIi(M81-99aa)、His/cIi(Cyt-Tra)、His/cIi(CLIP-TRIM)以及His分別加入柱內(nèi)，孵育1 h后用10 mmol·L-1谷胱甘肽洗脫液洗脫，收集蛋白洗脫液，分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶和免疫印跡法的特異性鑒定結(jié)果判定蛋白間有無相互作用關(guān)系。具體操作方法同陳芳芳等[21]。

2 結(jié) 果

2.1 Ii功能域和突變體基因的克隆及其鑒定

首先，應(yīng)用PCR和重疊延伸擴(kuò)增技術(shù)獲得了5個(gè)目的基因片段，在瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測(cè)中，cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M81-99aa)大小均為672 bp(圖1泳道1、3、5)，cIi(Cyt-Tra)和cIi(CLIP-TRIM)大小分別為258和450 bp(圖1泳道7、9)，這些擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。其次，將這些片段插入相應(yīng)載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，其產(chǎn)物在相應(yīng)泳道中均出現(xiàn)預(yù)期大小的片段(圖1泳道2、4、6、8和10)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5、7、9.PCR產(chǎn)物；2、4、6、8、10.質(zhì)粒Xho I/EcoR I 雙酶切產(chǎn)物M.DNA marker;1,3,5,7,9.PCR amplified proudct;2,4,6,8,10.Recombinant plasmids digested with Xho I and EcoR I圖1 基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.1 Amplification of genes and identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion

2.2 真核表達(dá)的Ii結(jié)構(gòu)域、Ii突變體與Rab5a和Rab7b的細(xì)胞內(nèi)共定位

為確定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的定位特性，將含綠色熒光的重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cIi、pEGFP-C1-cIi(M81-87aa)、pEGFP-C1-cIi(M91-99aa)、pEGFP-C1-cIi(M81-99aa)、pEGFP-C1-cIi(Cyt-Tra)、pEGFP-C1-cIi(CLIP-TRIM)、pEGFP-C1與含紅色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-cRab5a(或者pmCherry-C1-cRab7b)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞。應(yīng)用免疫印跡法進(jìn)行蛋白質(zhì)特異性的鑒定。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組綠色熒光蛋白/紅色熒光蛋白分別被抗GFP/RFP抗體所識(shí)別，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符合的條帶(圖2A、B)，這說明所構(gòu)建的重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)相關(guān)目的蛋白的共定位關(guān)系(圖3)。對(duì)照組GFP/cIi與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)定位于細(xì)胞內(nèi)同一部位而在疊加圖中呈現(xiàn)黃色(圖3A、B中a)；同樣，GFP/cIi(M81-87aa)、GFP/cIi(M91-99aa)、GFP/cIi(M81-99aa)、GFP/cIi(Cyt-Tra)也均與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)在細(xì)胞內(nèi)共定位而呈現(xiàn)黃色(圖3A和3B b、c、d和e)；GFP/cIi(CLIP-TRIM)均勻分布于整個(gè)細(xì)胞(圖3A、B f)，而空載體GFP則更多定位于細(xì)胞核，兩者在疊加圖中均不顯示出與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)共定位的黃色(圖3A、B g)。以上結(jié)果表明，Ii、cIi(Cyt-Tra)及Ii突變體均可以與cRab5a或cRab7b在細(xì)胞內(nèi)共定位，而CLIP與三聚體[cIi(CLIP-TRIM)]卻不能。

圖2 Ii功能域、Ii突變體、Rab5a和Rab7b分子真核表達(dá)蛋白的鑒定Fig.2 Identification of Ii domain，its mutants,Rab5a and Rab7b in eukaryotic expression

GFP.綠色熒光蛋白；RFP.紅色熒光蛋白；標(biāo)尺=50 μm；箭頭所指為關(guān)聯(lián)分子的共定位GFP.Green fluorescent protein;RFP.Red fluorescent protein;Bar=50 μm;the arrows show the co-localization of associated molecules圖3 cIi突變體和功能域與Rab5a和Rab7b在真核細(xì)胞的共定位Fig.3 Colocalization of mutant and functional domain cIi with Rab5a and Rab7b in eukaryotic cells

2.3 原核表達(dá)的Ii結(jié)構(gòu)域、Ii突變體重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)與純化

構(gòu)建的重組菌Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-99aa)和空載體重組菌Rosetta(DE3)pET-32a進(jìn)行蛋白的表達(dá)和純化，如圖所示，它們表達(dá)的蛋白His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)、His/cIi(M81-99aa)和His/cIi分子量相近分別為46.2 ku，而His蛋白大小為22 ku(圖4A泳道 2、3、4、1和5)。而Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(CLIP-TRIM)和Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(Cyt-Tra)表達(dá)的蛋白大小分別為38.5和31.1 ku(圖4B泳道 1和2)，所表達(dá)的蛋白大小與預(yù)期相符合，這表明所構(gòu)建的重組質(zhì)?？梢哉_表達(dá)目的蛋白。

圖4 cIi突變體與功能域原核表達(dá)蛋白的純化Fig.4 Purification of prokaryotic expression protein of Ii mutant and functional domain

2.4 原核表達(dá)的Ii結(jié)構(gòu)域、Ii突變體結(jié)合Rab5a和Rab7b特征的確定

為了解析Ii突變體[His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)]與cRab5a/7b的相互作用關(guān)系，應(yīng)用Pull-down方法進(jìn)行檢測(cè)。GST/cRab5a、GST/cRab7b和GST分別作為錨定蛋白，GST或者帶GST標(biāo)簽的蛋白可以與填料結(jié)合而留在柱內(nèi)，當(dāng)后加入的His標(biāo)簽蛋白的樣品中存在與其結(jié)合的部分則隨之被留在柱內(nèi)，最后被解離液洗脫下來。如果沒有與其結(jié)合的蛋白則最后解離液中只有單一的GST/cRab5a、GST/cRab7b或GST蛋白存在。

每組均以經(jīng)證實(shí)的His/cIi與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)作為陽性對(duì)照，先檢測(cè)His/cIi(M81-87aa)的結(jié)合特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)先結(jié)合在親和層析柱時(shí)，后加入柱子中的His/cIi和His/cIi(M81-87aa)可以與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結(jié)合而在解離液中出現(xiàn)兩個(gè)條帶，分別是His/cIi與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)和His/cIi(M81-87aa)與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)(圖5A、B的泳道2、3)，且解離條帶與相應(yīng)蛋白條帶大小一致(圖5A、B的泳道5、6)，His空載體不與其相結(jié)合而出現(xiàn)單一條帶(圖5A、B的泳道4)。對(duì)照組的GST與His/cIi、His/cIi(M81-87aa)共同孵育時(shí)，僅出現(xiàn)GST標(biāo)簽蛋白的單一條帶(圖5A和B的泳道8、9)。進(jìn)一步應(yīng)用抗His的抗體對(duì)相應(yīng)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相應(yīng)泳道出現(xiàn)特異性條帶(圖5A、B的泳道2、3、5、6和7)。用相同的方法和步驟檢測(cè)了His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)分別與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)的結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們的解離液中均出現(xiàn)2條帶，分別是GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)和His/cIi(M91-99aa)(或者His/cIi(M81-99aa))(圖6A、B的泳道2、3)，且解離條帶與相應(yīng)蛋白條帶大小一致(圖6A、B的泳道4、5)，而對(duì)照組均為標(biāo)簽蛋白GST的單一蛋白條帶(圖6A、B的泳道6、7)。

圖5 His/cIi(M81-87aa)和GST/cRab5a與GST/cRab7b結(jié)合的鑒定Fig.5 Identification of binding of His/cIi(M81-87aa)with GST/cRab5a and GST/cRab7b

圖6 His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)與GST/cRab5a和GST/cRab7b蛋白質(zhì)相互作用的鑒定Fig.6 Identification of binding of His/cIi(M91-99aa)and His/cIi(M81-99aa)with GST/cRab5a and GST/cRab7b proteins

以上結(jié)果表明，Ii突變體均可以與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結(jié)合，且這種結(jié)合不受標(biāo)簽蛋白的影響。這說明，Ii突變體也可以與Rab5a和Rab7b結(jié)合，Ii的CLIP區(qū)域不是其結(jié)合的主要結(jié)構(gòu)域。

2.5 cIi結(jié)合Rab5a和Rab7b功能域的確定

進(jìn)一步應(yīng)用相同方法驗(yàn)證His/cIi(Cyt-Tra)和His/cIi(CLIP-TRIM)與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結(jié)合。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在解離液中出現(xiàn)兩個(gè)條帶，分別是His/cIi(Cyt-Tra)和GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)(圖7A、B泳道2)，與對(duì)應(yīng)的蛋白條帶大小一致(圖7A、B泳道3)，而His/cIi(CLIP-TRIM)不能與之結(jié)合，在電泳圖中僅有一條條帶(圖7A、B泳道4)，對(duì)照組中的GST亦不能與His/cIi(Cyt-Tra)或His/cIi(CLIP-TRIM)結(jié)合(圖7A、B泳道6、7)。這說明Ii與Rab5a(或者Rab7b)結(jié)合的功能域是胞漿區(qū)和跨膜區(qū)，不是CLIP和三聚體區(qū)。

圖7 His/cIi(Cyt-Tra)和His/cIi(CLIP-TRIM)與GST/cRab5a和GST/cRab7b結(jié)合的鑒定Fig.7 Identification of binding of His/cIi(Cyt-tra)and His/cIi(CLIP-TRIM)with GST/cRab5a and GST/cRab7b

3 討 論

本研究應(yīng)用拉下法檢測(cè)了關(guān)聯(lián)蛋白Ii結(jié)合Rab5a或Rab7b的分子特征。該法曾在課題組檢測(cè)Ii與MHC分子結(jié)合中得到驗(yàn)證[7]；還應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察了Ii與Rab分子在細(xì)胞內(nèi)共定位的特征。課題組曾在前期工作中應(yīng)用細(xì)胞器定位蛋白檢測(cè)Rab5a或Rab7b在細(xì)胞內(nèi)分布，發(fā)現(xiàn)它們均定位于細(xì)胞內(nèi)吞體[20-21]。本研究結(jié)果(圖3)表明，Ii(包括Ii胞漿區(qū)和跨膜區(qū)片段)能與Rab分子在內(nèi)吞體共定位?？傊?，本研究獲得了以下重要結(jié)果。

首先，Ii的胞漿區(qū)和跨膜區(qū)不僅能結(jié)合Rab分子，還是細(xì)胞內(nèi)定位的功能結(jié)構(gòu)域。雞Ii由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)。其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)由CLIP(81—107 aa)和三聚體區(qū)組成。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，Ii的跨膜區(qū)和胞漿區(qū)具有引導(dǎo)抗原肽進(jìn)入內(nèi)吞體的功能[7]。在本研究中，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別具有結(jié)合Rab5a和Rab7b的功能(圖7)；更重要的是，由于Ii只有在細(xì)胞內(nèi)遷移中，才能發(fā)揮其從裝配成熟MHC Ⅱ類分子到協(xié)助提呈外源性抗原肽不同功能，而Rab分子是胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所以，這兩類分子的結(jié)合和在細(xì)胞內(nèi)的共定位，不僅表明Rab分子參與Ii的胞內(nèi)遷移，也提示Ii分解成胞漿區(qū)和跨膜區(qū)在遷移過程中可能存在其他重要功能，如研究發(fā)現(xiàn)，其可遷移到細(xì)胞核進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的釋放，并影響B(tài)細(xì)胞受體信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。此外，由于課題組在用細(xì)胞器定位的研究中已表明，Rab5a和Rab7b均定位于內(nèi)吞體[20-21]，所以，Ii與Ii的胞漿區(qū)和跨膜區(qū)片段分別與這兩種分子共定位(圖2)，表明它們均可進(jìn)入內(nèi)吞體。

其次，本研究結(jié)果表明，Ii的CLIP盡管與結(jié)合Rab分子無關(guān)，但是對(duì)Ii分子在細(xì)胞定位是不可缺失的，它是保持空間結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵片段。Ii和MHC Ⅱ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成九聚體，期間Ii的CLIP占據(jù)MHC Ⅱ類分子凹槽，在遷移至內(nèi)吞體后，Ii 被分解，抗原肽取代CLIP，與MHC Ⅱ類分子形成MHC-抗原肽復(fù)合物，最后被提呈給T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在此過程中，CLIP是重要結(jié)構(gòu)域[23]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，缺失部分CLIP片段的Ii[cIi(D81-87aa)和cIi(D91-99aa)]，盡管還能維持結(jié)合Rab5a的特性，卻改變了其在細(xì)胞內(nèi)的定位，即缺失后的Ii分布于整個(gè)細(xì)胞，而不是細(xì)胞質(zhì)[20]，但是不清楚這種細(xì)胞定位的改變是否由于CLIP片段缺失導(dǎo)致的空間結(jié)構(gòu)變化。由于CLIP分子量較小，難以在體外形成空間結(jié)構(gòu)，故本研究通過突變CLIP的關(guān)鍵位點(diǎn)[cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M91-99aa)]，探明上述問題。結(jié)果表明，突變CLIP后的Ii仍定位于細(xì)胞質(zhì)，這提示Ii的CLIP對(duì)維持其在細(xì)胞內(nèi)定位至關(guān)重要，由于Ii胞漿區(qū)和跨膜區(qū)具有結(jié)合Rab5a或Rab7b功能，故3個(gè)Ii突變體均維持與Rab分子結(jié)合。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，Ii的胞漿區(qū)和跨膜區(qū)不僅能結(jié)合Rab5a或Rab7b分子，還是其在細(xì)胞內(nèi)定位的功能結(jié)構(gòu)域。Ii的CLIP與結(jié)合Rab5a或Rab7b分子無關(guān)，卻是保持Ii分子空間結(jié)構(gòu)和維持細(xì)胞內(nèi)定位特性的關(guān)鍵片段。