宋鵬琰，錫建中，張振紅，付 強，岳巧嫻，張配穎，周榮艷

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071001)

顆粒細胞(granulosa cells，GCs)作為哺乳動物卵巢的主要功能細胞，在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮至關重要的作用。卵泡發(fā)育起始于顆粒細胞的發(fā)育，竇前卵泡發(fā)育后期，顆粒細胞開始表達FSHR，可使雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に兀龠M卵泡發(fā)育，形成優(yōu)勢卵泡[1]。研究發(fā)現(xiàn)，卵泡在不同發(fā)育階段都存在卵泡閉鎖[2]，而卵泡閉鎖受多種因素調(diào)節(jié)，其中卵泡顆粒細胞的凋亡就能夠直接誘發(fā)卵泡閉鎖[3-4]。

microRNA(miRNA)是一種細胞內(nèi)源性長度約22～24 nt的非編碼RNA，通過調(diào)控靶基因參與多種細胞過程，如細胞凋亡、分化和增殖[5-6]。利用高通量測序技術從不同物種的卵巢組織中鑒定出大量miRNAs[7-12]，研究發(fā)現(xiàn)其廣泛參與原始卵泡募集[13-14]、優(yōu)勢卵泡選擇[15]、顆粒細胞增殖分化[16]、甾體類激素的合成與分泌[17-19]、卵母細胞成熟[20]、排卵[21]以及黃體形成[22]等卵泡發(fā)育的各個環(huán)節(jié)[23]。miR-483-5p和miR-486-5p與人卵丘細胞的增殖和卵泡的發(fā)育相關[24]，miR-145影響轉(zhuǎn)化生長因子β受體2(TGFBR2)基因的表達進而調(diào)控始基卵泡的募集[13]，miR-150通過抑制類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)基因的表達影響類固醇激素的合成和分泌[17]。miR-214-3p可能通過靶向線粒體融合蛋白-2(MFN2)和核受體5A1(NR5A1)調(diào)控豬顆粒細胞增殖和雌激素的合成[18]。因此，miRNA在動物卵巢周期性變化、激素合成和繁殖過程發(fā)揮重要調(diào)控作用。

miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，且在脊椎動物高度保守[25]。miR-200a和miR-141可能通過靶向CD36和腫瘤壞死因子α刺激因子-6(TNFAIP6)調(diào)控山羊的卵泡發(fā)育[26]，miR-200b可能通過下調(diào)GNAQ反饋調(diào)控GnRH的表達來調(diào)控綿羊的發(fā)情過程[27]。此外，敲除miR-200b和miR-429的雌性小鼠不排卵[28]，敲除miR-429a、miR-200a和miR-200b 顯著降低斑馬魚的精子運動[29]。miR-200s參與動物卵泡發(fā)育、發(fā)情周期、排卵及精子運動等生物過程，由此可見其與動物生殖密切相關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-200s在小尾寒羊發(fā)情期和間情期卵巢中差異表達[30]。研究證實，miR-200b可以通過直接靶向結合磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)3′UTR抑制卵巢顆粒細胞(KGN)增殖[31]。本試驗以miR-200b為研究對象，初步探索其對綿羊卵泡顆粒細胞增殖凋亡過程的影響，為進一步研究miR-200b對綿羊卵泡發(fā)育的調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清FBS(Gibco，美國)購自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)有限公司；CCK8檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所(Dojindo，日本)；HiPerFect Transfection Reagent 購自 QIAGEN。miR-200b mimic、miR-200b inhhibitor、mimic NC、inhibitor NC由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2 綿羊miR-200b的生物信息學分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫查找各物種miR-200b的成熟序列。利用在線工具TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRDB(http://www.mirdb.org/index.html)和miRTarBase(http://mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)分別對miR-200b進行靶基因預測，將數(shù)據(jù)進行分析整理，利用在線工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/?t=1)對靶基因進行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。

1.3 綿羊卵泡顆粒細胞的分離培養(yǎng)

綿羊(小尾寒羊)卵巢采自保定瑞麗肉食品有限公司。將采集的卵巢置于37 ℃生理鹽水(含1%雙抗)中運回實驗室。75%酒精潤洗消毒后，預熱生理鹽水洗滌3次，剪去多余脂肪和系膜，轉(zhuǎn)至超凈臺。PBS洗3次，利用無菌刀片在無血清培養(yǎng)基中輕輕劃破卵泡(3～7 mm)，使卵泡液混于培養(yǎng)基中。然后將混合液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清，PBS洗滌兩次，加入2 mL DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%雙抗和50 μg·mL-1丙酮酸鈉)吹打混勻后接種于25 cm細胞培養(yǎng)瓶中，再加入3 mL完全培養(yǎng)基。最后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預培養(yǎng)過夜。第2天清洗換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞匯合度達70%～90%時傳代。

1.4 綿羊卵泡顆粒細胞的轉(zhuǎn)染與增殖檢測

轉(zhuǎn)染前以每孔2×104的密度將顆粒細胞接種于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，每組6個重復，37 ℃預培養(yǎng)。用opti-M分別稀釋50 nmol·L-1miR-200b mimic(過表達組)、mimic NC(mimic陰性對照組)和100 nmol·L-1miR-200b inhibitor(抑表達組)、inhibitor NC(inhibitor陰性對照組)，低速漩渦混勻，加入0.75 μL HiPerFect Transfection Reagent，低速漩渦混勻，室溫靜置10 min，形成轉(zhuǎn)染復合體。然后將轉(zhuǎn)染復合體逐滴加至96孔板中。分別在顆粒細胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，每孔加10 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，利用酶標儀檢測吸光度(450 nm)，觀察細胞增殖情況。試驗重復3次。

1.5 引物設計

采用莖環(huán)法設計綿羊miR-200b引物，其反轉(zhuǎn)錄引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCATCATTA，上游引物序列：GCCGAGTAATACTGCCTGG，下游通用序列：CTCAACTGGTGTCGTGGA，并以U6為內(nèi)參基因。利用Primer 3.0軟件設計其他基因的引物,并通過NCBI中Primer-BLAST初步查驗引物特異性。CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax及Bcl-2表達量的檢測均以GAPDH為內(nèi)參基因。引物均由通用生物系統(tǒng)有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.6 基因表達檢測

轉(zhuǎn)染前，以每孔2.5×105的密度將顆粒細胞接種于6孔板，每孔2 300 μL細胞懸液，每組3個重復，37 ℃ 預培養(yǎng)。用opti-M分別稀釋50 nmol·L-1miR-200b mimic、mimic NC和100 nmol·L-1miR-200b inhibitor、inhibitor NC，低速漩渦混勻，加入12 μL HiPerFect Transfection Reagent，低速漩渦混勻，室溫靜置10 min，形成轉(zhuǎn)染復合體。然后將轉(zhuǎn)染復合體逐滴加至6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2次，利用TRIzolTMReagent提取RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(寶生物)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。首先除去DNA，反應體系：RNA 800 μg，5×gDNA Reaction Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNase-free dH2O 補至10 μL；42 ℃孵育2 min，4 ℃保存。然后進行反轉(zhuǎn)錄，20 μL 反應體系：上述反應液 10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL，RNase Free dH2O 4 μL。輕輕混勻，37 ℃孵育15 min，85 ℃ 加熱失活5 s，產(chǎn)物-20 ℃保存。最后使用Forget-Me-NotTMEvagreen?qPCR Master Mix(Biotium)進行qRT-PCR檢測，反應體系：2×Forget-Me-NotTMqPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orget-Me-Not EvaGreen ROX Reference Dye 3 μL，RNase-free dH2O 4.2 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 5 s共40個循環(huán)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism進行作圖。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法進行計算。結果以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。

2 結 果

2.1 綿羊miR-200b生物信息學分析

利用NCBI和miRBase查出各物種miR-200b成熟序列，其種子區(qū)域均為AAUACU，說明miR-200b核心序列在各物種間高度保守(圖1A)。利用3種在線工具TargetScan、miRTarBase以及miRDB分別預測出1 196、51和1 246個基因與miR-200b有靶向關系，并用Venny2.1在線網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對預測的結果進行交互繪制，如圖1B所示。其中，3個軟件預測出25個共同靶基因。GO分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要富集在細胞的增殖分化、細胞周期及生殖發(fā)育過程(圖1C)；KEGG分析發(fā)現(xiàn)，miR-200b除了參與癌癥相關通路，還參與Ras信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路及雌激素信號通路等(圖1D)，且這些信號通路與細胞周期、細胞生物學過程及生殖過程相關。

A.不同物種miR-200b成熟序列；B.miR-200b預測靶基因的韋恩圖；C.GO富集分析；D.KEGG通路富集分析A.miR-200b mature sequence of various species;B.Venn diagram of miR-200b predicted target genes;C.GO enrichment analysis;D.KEGG pathway enrichment analysis圖1 miR-200b的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of miR-200b

2.2 miR-200b對顆粒細胞增殖的影響

從圖2中可以看出，與mimic NC相比，miR-200b mimic轉(zhuǎn)染24 h顆粒細胞存活率并無顯著變化(P>0.05)，但48和72 h細胞存活率均極顯著降低(P<0.01)；與inhibitor NC相比，miR-200b inhibitor轉(zhuǎn)染24 h細胞存活率顯著升高(P<0.05)，48 h極顯著升高(P<0.01)，但72 h無顯著變化(P>0.05)。隨轉(zhuǎn)染時間延長，各組細胞存活率呈“V”型變化趨勢，且在48 h達到最低。因此，轉(zhuǎn)染miR-200b可降低顆粒細胞存活率，抑制細胞增殖，并有一定時間效應，本試驗選取轉(zhuǎn)染48 h進行后續(xù)試驗。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001。下同*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.The same as below圖2 轉(zhuǎn)染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor及NC的顆粒細胞存活率Fig.2 The survival rate of granulosa cell transfected with miR-200b mimic,miR-200b inhibitor and NC

2.3 miR-200b基因在卵泡顆粒細胞中的表達量檢測

轉(zhuǎn)染miR-200b mimic組的miR-200b表達量是mimic NC組的1 391.50倍(圖3)，差異極顯著(P<0.001)；而mimic NC、inhibitor NC及miR-200b inhibitor 組的miR-200b表達量基本接近，無顯著差異(P>0.05)。

圖3 miR-200b在卵泡顆粒細胞中的表達水平Fig.3 The expression level of miR-200b in follicular granulosa cells

2.4 miR-200b對細胞周期相關基因表達的影響

從圖4中可以看出，與mimic NC相比，轉(zhuǎn)染miR-200b mimic極顯著下調(diào)CDK4(P<0.01)、CDK6(P<0.001)及CCND1(P<0.001)基因表達水平，顯著下調(diào)CCND2基因的表達水平(P<0.05)。表明，miR-200b可抑制細胞周期進程。

圖4 轉(zhuǎn)染miR-200b mimic和mimic NC的顆粒細胞周期相關基因表達水平Fig.4 The expression level of cell cycle related genes in granulosa cells transfected with miR-200b mimic and mimic NC

2.5 miR-200b對顆粒細胞凋亡相關基因表達的影響

從圖5中可以看出，與mimic NC相比，轉(zhuǎn)染miR-200b mimic極顯著抑制Bcl-2基因表達水平(P<0.01)，而對Bax基因mRNA表達水平無顯著影響(P>0.05)。此外，轉(zhuǎn)染miR-200b mimic極顯著下調(diào)Bcl-2與Bax的比值(P<0.001)。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-200b mimic和mimic NC的顆粒細胞凋亡相關基因表達水平Fig.5 The expression level of apoptosis related genes in granulosa cells transfected with miR-200b mimic and mimic NC

3 討 論

卵泡發(fā)育是一個復雜精密的周期性過程，顆粒細胞作為哺乳動物卵巢的主要功能細胞，其生長分化在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵性的作用。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術，對1和8月齡湖羊的卵巢組織分別進行測序，鑒定出miR-200a、miR-200b和miR-200c為其中3個差異表達的miRNAs，且與1月齡湖羊卵巢相比，8月齡的表達量顯著下調(diào)，說明miR-200s與綿羊卵巢發(fā)育息息相關[32]。通過構建和分析小尾寒羊間情期和發(fā)情期卵巢組織miRNA表達譜，篩選出這兩個時期差異表達的miRNAs，經(jīng)進一步分析獲得miR-200a、miR-200b和miR-200c這3個顯著差異表達的miRNAs，且在發(fā)情期較間情期均表達下調(diào)[30,33]。本研究對綿羊miR-200b靶基因進行GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與細胞的增殖分化、細胞周期及生殖發(fā)育過程，表明miR-200b調(diào)控細胞生物學過程。因此，本試驗針對miR-200b對綿羊卵泡顆粒細胞周期和凋亡的影響進行了研究。

通過檢測細胞存活率，發(fā)現(xiàn)各處理組均存在先降后升的現(xiàn)象，這可能與綿羊卵泡顆粒細胞和miR-200b轉(zhuǎn)染時間相關。對于綿羊卵泡顆粒細胞，24 h轉(zhuǎn)染時間較短，轉(zhuǎn)染效率較低，72 h轉(zhuǎn)染時間較長轉(zhuǎn)染可能逐步失效，而48 h轉(zhuǎn)染效果很顯著，說明轉(zhuǎn)染效率高，因此后續(xù)試驗均選擇轉(zhuǎn)染48 h。通過檢測miR-200b表達量，發(fā)現(xiàn)miR-200b mimic組極顯著升高，而miR-200b inhibitor組和inhibitor NC組并無顯著差異，可能是由于綿羊卵泡顆粒細胞inhibitor選用劑量較低，效果不理想，因此后續(xù)試驗只選用了mimic及其NC處理組進行過表達研究。研究表明，miRNA影響顆粒細胞增殖和凋亡過程。miR-214-3p能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)細胞周期相關基因(CyclinB、CyclinD、CyclinE及CDK4)表達從而促進豬顆粒細胞增殖[18]，miR-16過表達促進顆粒細胞增殖，誘導細胞周期進程并抑制細胞凋亡[34]，而miR-379-5p過表達抑制顆粒細胞增殖[35]。本研究中，miR-200b過表達降低顆粒細胞存活率，并下調(diào)CDK4、CDK6、CCND1和CCND2基因表達，而上述4個基因參與細胞周期G1期的進程及G1/S期轉(zhuǎn)化。因此，miR-200b通過抑制綿羊顆粒細胞G1期相關基因表達影響細胞周期，從而抑制細胞增殖。與本試驗結果一致，He等[31]發(fā)現(xiàn)，過表達miR-200b可抑制人卵巢顆粒細胞(KGN)增殖。

Zhang等[36]對miRNA與顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖的調(diào)控關系進行了綜述分析得出，miRNA調(diào)控的卵泡閉鎖主要是由顆粒細胞凋亡所致。miR-1275促進豬顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖并通過損害LRH-1/CYP19A1軸調(diào)控E2分泌[37]，miR-204-5p通過靶向Bcl-2調(diào)控大鼠卵巢顆粒細胞凋亡[38]。本研究中，miR-200b過表達能從轉(zhuǎn)錄水平抑制Bcl-2表達并極顯著下調(diào)Bcl-2與Bax比值，促進綿羊卵泡顆粒細胞凋亡。Bcl-2家族調(diào)控細胞凋亡屬于介導細胞凋亡的最重要途徑——線粒體途徑。Bax的過表達可以加速誘導顆粒細胞的凋亡，而Bcl-2基因過表達可以拮抗Bax基因，抑制卵泡膜細胞及顆粒細胞的凋亡，控制卵母細胞凋亡，進而延緩卵泡閉鎖[39]。Bax/Bcl-2的比值可以揭示細胞的生長或凋亡情況[40]。顆粒細胞凋亡是導致發(fā)育期卵泡閉鎖的關鍵因素[41-43]，本研究中，綿羊卵泡顆粒細胞Bcl-2/Bax比值降低，表明miR-200b促進了細胞凋亡，推測其可能對綿羊卵巢卵泡閉鎖具有重要調(diào)控作用。

4 結 論

本研究結果表明，miR-200b通過降低顆粒細胞存活率抑制細胞增殖、促使細胞周期相關基因表達量降低、下調(diào)Bcl-2/Bax比值來抑制細胞周期并促進細胞凋亡進而調(diào)控綿羊卵泡顆粒細胞。