朱帥鵬，王東雪，劉 聰，孫君衛(wèi)，杜振偉，孫桂榮，李文婷

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，鄭州 450046)

卵透明帶蛋白(ZP)是圍繞在卵子周圍的一層糖蛋白基質(zhì)[1]，其結(jié)構(gòu)與功能是以幾種蛋白之間相互作用為基礎(chǔ)[2]。ZP糖蛋白最早是在初級卵泡中合成[3]，被轉(zhuǎn)化酶處理之后分泌到細胞外[4]，在細胞外ZP蛋白受到水解酶切割形成單體(ZP1、ZP2、ZP3和ZP4)，其中ZP3是精子的最初受體[5-6]，它對卵子的生成、精卵結(jié)合以及早期胚胎發(fā)育都具有重要的作用[7]。ZP3與精子蛋白受體結(jié)合引發(fā)頂體反應(yīng)[8]，促進精卵結(jié)合從而完成受精[9]，除此之外ZP3還參與阻止多精入卵，有助于子宮內(nèi)受精卵的貼附[10]。

ZP3可以與ZP1、ZP2、ZP4分別結(jié)合形成3種二聚體[11]，構(gòu)成ZP蛋白的結(jié)構(gòu)框架，缺乏ZP1蛋白的卵母細胞不能形成正常的ZP組織[12]，缺乏ZP3的雌性小鼠不能形成ZP蛋白[13]，ZP3的突變會使其與ZP2之間作用機制受到影響，會導(dǎo)致女性空卵泡綜合征[14]進而引起人類不育[15]，同時有研究證實，ZP3變異與綿羊[16]、豬等的產(chǎn)羔數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。在小鼠中敲除ZP3后不能形成卵透明帶蛋白[17]，研究者們因此認為，ZP3蛋白可能是免疫不育的潛在靶抗原[18]。

目前有多種動物的ZP3 cDNA序列得到擴增，如褐家鼠、草原兔尾鼠、牦牛、野豬、歐洲兔等。但關(guān)于雞ZP3基因研究較少，因此，本試驗通過對海蘭褐蛋雞ZP3全長克隆，對其編碼區(qū)序列進行分析和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，并和多種不同物種的編碼序列進行比對分析構(gòu)建基因進化樹，為雞ZP3及其功能的研究提供理論依據(jù)。通過構(gòu)建海蘭褐蛋雞ZP3在不同組織、不同發(fā)育階段卵泡以及不同發(fā)育階段的卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞的表達譜，分析ZP3在雞卵泡發(fā)育過程中的表達特征，為ZP3基因在卵泡發(fā)育過程中作用的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

50周齡(50 W)海蘭褐蛋雞6只，其生長健康狀況相似且產(chǎn)蛋率均達到了70%以上。頸部脫臼致死，并取其心、肝、肺、腎、胸肌、腿肌、卵巢組織，收集50 W海蘭褐蛋雞各等級卵泡分離膜細胞和顆粒細胞，提取總RNA之后用于后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑及儀器

氯仿、異丙醇、DEPC水溶液、無水乙醇、RNA提取試劑Trizol、胰蛋白酶(Solarbio)，青鏈霉素混合液(Solarbio)，胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(BI)，熒光倒置顯微鏡(Nikon，Japan)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE試劑盒(TaKaRa)，熒光定量試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)；4 ℃離心機、細胞培養(yǎng)箱、超微量分光光度計(美國Thermo公司)，定量PCR儀(LightCycler96，瑞士Roche公司)等。

1.3 引物設(shè)計

使用引物設(shè)計軟件Oligo7，利用NCBI已知雞CDS區(qū)序列(NM_204389.2)設(shè)計引物F0、R0，用擴增得到的序列設(shè)計巢式PCR引物F1、R1、F2、R2、F3、R3，設(shè)計定量引物F、R，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物均由尚亞生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 ZP3基因全長擴增

利用RACE試劑盒，以卵泡3′和5′ RACE-cDNA為模板，用通用引物UPM分別與F1、R1進行巢式PCR第一輪擴增，以3′ UTR擴增為例，反應(yīng)體系為50 μL：3′ RACE-cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，引物F11 μL，2×Taq Buffer 25 μL，RNase-free ddH2O 16.5 μL。反應(yīng)程序選擇Touchdown程序：第一步95 ℃ 5 min；第二步95 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共20個循環(huán)；第三步95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共20個循環(huán)；最后4 ℃保存。將第一輪擴增產(chǎn)物稀釋50倍后作為模板，以通用引物NEST和F2、R2分別進行第二輪巢式PCR，反應(yīng)體系為50 μL：稀釋后產(chǎn)物5 μL，引物F21 μL，引物NEST 1 μL，2×Taq Buffer 25 μL，RNase-free ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序：第一步95 ℃ 5 min；第二步95 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共20個循環(huán)；第三步72 ℃ 10 min；最后4 ℃保存。再將產(chǎn)物稀釋50倍后，以引物NEST分別和F3、R3進行第三輪巢式PCR，步驟及反應(yīng)程序與第二輪巢式PCR一致。將產(chǎn)物進行凝膠電泳分離后，選擇單一條帶進行切膠回收，連接T載體之后進行測序拼接。

1.5 ZP3基因進化樹構(gòu)建及編碼區(qū)生物信息學(xué)分析

利用MegAlign軟件對擴增得到的雞ZP3的CDS序列及已有的斑馬魚NM_131331.1、狗NM_001003224.1、牛NM_173974.3、人NM_007155.6、鼠M20026.1、兔NM_001195720.1、豬NM_213893.1 ZP3的核酸序列和氨基酸序列分別進行同源性比對，利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同時利用PSIPRED對ZP3氨基酸序列進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測海蘭褐蛋雞ZP3蛋白三級結(jié)構(gòu)，使用ProtParam工具對ZP3理化性質(zhì)進行分析，通過TMHMM對ZP3蛋白進行跨膜區(qū)分析，通過SignaiP-5.0 Server工具對ZP3蛋白進行信號肽檢測，通過EXPASY網(wǎng)站在線分析ZP3蛋白親疏水性。

1.6 雞原代卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞分離培養(yǎng)與激素處理

采用本實驗室成熟技術(shù)方法[19]分別收集不同等級卵泡：小白卵泡(SWF:1～3.9 mm)、大白卵泡 (LWF:4～4.9 mm)、小黃卵泡(SYF:5～8 mm)和等級卵泡(F6:9～15 mm、F5:16～20 mm、F4:21～25 mm、F3:26～30 mm、F2:31～35 mm、F1:136～40 mm)，分離雞不同等級卵泡顆粒細胞以及膜細胞，接種于培養(yǎng)瓶，待其生長密度達到90%，利用TRIzol消化裂解細胞并提取總RNA進行后續(xù)試驗。取部分等級卵泡顆粒細胞分為4組，分別添加濃度為5、10、50 ng·mL-1的 FSH，對照組添加等量PBS，處理 24 h，去除培養(yǎng)基，用 PBS 進行沖洗后，加入適量TRIzol裂解提取總RNA。

1.7 總RNA反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄第一步反應(yīng)體系：4 μL 4×gDNA wiper Mix，Total RNA 1 pg-1 μg，添加RNase-free ddH2O至總體系16 μL，設(shè)置反應(yīng)程序為：42 ℃ 2 min，4 ℃ 60 min；第二步反應(yīng)體系:4 μL 5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 加入到上一步產(chǎn)物中，總體系20 μL，設(shè)定反應(yīng)程序為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 60 min。反應(yīng)結(jié)束后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋兩倍，以便用于后續(xù)的實時熒光定量PCR。

1.8 ZP3基因qRT-PCR檢測

以不同組織和細胞樣品cDNA為模板進行熒光定量PCR，總反應(yīng)體系為10 μL：SYBR qPCR Master Mix 5 μL，RNase-free ddH2O 3 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序為：第一步95 ℃ 5 min；第二步95 ℃ 12 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，每個待測樣本3個生物學(xué)重復(fù)，2個技術(shù)重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計與分析

采用2-△△Ct法，以β-actin作為內(nèi)參基因，對ZP3基因進行熒光定量 PCR 分析。采用 SPSS24.0 的獨立樣本T-test 法檢驗不同樣本表達量的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 雞ZP3基因的克隆及cDNA全長獲得

為分析ZP3結(jié)構(gòu)功能，以雞卵泡cDNA為模板，用引物F0、R0擴增ZP3 CDS區(qū)，得到約1 341 bp 的條帶(圖1A)，通過回收純化連接T載體進行測序。同時通過RACE試劑盒克隆得到5′ RACE 產(chǎn)物351 bp (圖1B)，3′ RACE產(chǎn)物228 bp(圖1C)，條帶明亮且單一，說明沒有可變剪切體存在，經(jīng)純化回收連接T載體測序，拼接得到ZP3全長1 415 bp，其中編碼區(qū)1 341 bp，5′ UTR 8 bp，3′ UTR 36 bp，該基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，共編碼446個氨基酸，通過Ensembl網(wǎng)站的BLAST/BLAT分析，該基因位于10號染色體，共有9個外顯子，長度在90～375 bp之間。

圖1 雞ZP3 基因CDS區(qū)(A)、5′ RACE(B)、3′ RACE(C)產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis diagram of CDS region(A),5′ RACE(B)and 3′RACE(C)products of chicken ZP3 gene

2.2 雞ZP3基因序列分析

為分析ZP3在不同物種間的同源性，使用MegAlign將擴增得到的雞ZP3基因CDS序列與斑馬魚、狗、牛、人、鼠、兔、豬等7個不同物種ZP3核酸序列進行同源性比對，同源性分別為：60.8%、60.3%、50.4%、60%、57.6%、58.9%、55.5%，氨基酸序列同源性比對顯示同源性分別為：31.4%、47.8%、48.6%、47.9%、45.9%、46.8%、49.5%。使用Mega 7.0 軟件構(gòu)建進化樹，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明，雞ZP3基因在進化過程中符合物種進化規(guī)律，并且通過系統(tǒng)發(fā)生樹可以得出海蘭褐蛋雞與斑馬魚相距較近，與人和鼠次之，與豬最遠。

圖2 海蘭褐蛋雞ZP3基因進化樹Fig.2 ZP3 phylogenetic tree of Hailan brown laying hens

2.3 雞ZP3蛋白結(jié)構(gòu)功能分析

為研究海蘭褐蛋雞ZP3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，使用ProtParam工具對ZP3蛋白理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，該基因共編碼446個氨基酸，負電荷殘基總數(shù)45個，正電荷殘基總數(shù)為38個，其中丙氨酸所占比例最大(11.4%)，纈氨酸次之(10.3%)，甲硫氨酸含量最低(1.1%)，總原子數(shù)為6 623，分子式為C2079H3284N608O631S21，體外蛋白半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為44.91，將其歸類為不穩(wěn)定蛋白，相對分子質(zhì)量為47 565.90，理論PI為5.83。通過PSIPRED在線分析ZP3蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白主要由257個氨基酸殘基組成的無規(guī)則卷曲形成，占整個二級結(jié)構(gòu)的57.62%，是二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分；由137個氨基酸構(gòu)成延伸部分，占整體的30.72%，由52個氨基酸組成α-螺旋并占據(jù)整個結(jié)構(gòu)的11.65%，通過SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測海蘭褐蛋雞ZP3蛋白三級結(jié)構(gòu)(圖3A)，發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲占據(jù)主要成分，與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相符合。通過TMHMM和SIGNAIP-5.0 SERVERZP3對ZP3蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析，結(jié)果表明ZP3蛋白存在一個跨膜區(qū)(圖3B)，同時信號肽分析表明存在一個信號區(qū)域(圖3C)，表明該蛋白可以進行信息傳導(dǎo)，預(yù)測該蛋白可能具有信號傳遞的作用，通過蛋白質(zhì)親水性工具(Protein GRAVY)對其親水性總值進行計算，得到結(jié)果為0.002，表示該蛋白為弱的疏水性蛋白質(zhì)。

2.4 海蘭褐蛋雞不同組織中ZP3基因的表達分析

為研究ZP3基因在50 W海蘭褐蛋雞不同組織中的表達情況，采用qRT-PCR 的方法，以β-actin作為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖4所示，ZP3在心、肝、肺、腎、卵巢、胸肌、腿肌等組織中均有表達，在卵巢中的相對表達量最高，且顯著高于其它組織(P<0.05)，表示ZP3基因可能在卵巢中發(fā)揮重要生理作用。

A.ZP3的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.ZP3的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；C.ZP3的信號肽預(yù)測A.Prediction of ZP3 tertiary structure;B.Prediction of ZP3 transmembrane structure;C.Prediction of ZP3 signal peptide圖3 ZP3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.3 Prediction analysis of ZP3 protein structure

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05),the same as below圖4 不同組織中ZP3 的表達Fig.4 Expression of ZP3 in different tissues

2.5 雞ZP3基因在不同等級卵泡、顆粒細胞、膜細胞的表達

qRT-PCR檢測ZP3基因在不同等級卵泡、顆粒細胞、膜細胞中的表達，結(jié)果見圖5，在初始卵泡(F6)中表達量較低，隨著卵泡的生長發(fā)育，該基因表達量不斷升高，在F1階段表達量顯著高于F6階段(P<0.05)。

圖5 不同等級卵泡中ZP3的表達Fig.5 Expression of ZP3 in follicles of different grades

qRT-PCR檢測ZP3基因在不同等級卵泡顆粒細胞中的表達，結(jié)果見圖6，在卵泡發(fā)育初期基因表達量最低，隨著卵泡的發(fā)育，基因表達量增加，在卵泡發(fā)育近成熟(F1階段)，ZP3表達量顯著高于其他階段(P<0.05)。ZP3在不同等級卵泡膜細胞中的表達情況見圖7，卵泡膜細胞ZP3表達趨勢和卵泡顆粒細胞相似，小黃卵泡中表達量最低，在F1階段表達量最高。ZP3總體呈現(xiàn)逐漸上升表達趨勢，并且趨勢與卵泡中表達趨勢一致，但是在顆粒細胞中表達量明顯高于膜細胞，表示該基因主要在顆粒細胞中發(fā)揮主要功能。

圖6 不同等級卵泡顆粒細胞中ZP3的表達Fig.6 Expression of ZP3 in follicular granulosa cells of different grades

圖7 不同等級卵泡膜細胞中ZP3的表達Fig.7 Expression of ZP3 in theca cells of different grades

2.6 不同濃度FSH對卵泡顆粒細胞中ZP3基因表達的影響

為研究不同濃度FSH對卵泡顆粒細胞中ZP3表達量的影響，分別采用5、10、50 ng·mL-1濃度的FSH對卵泡顆粒細胞進行處理，24 h后收集細胞樣品，采用熒光定量PCR進行基因表達量檢測，結(jié)果如圖8所示，3種濃度的處理組之間并無顯著差異，但均顯著高于空白對照組(P<0.05)。

圖8 不同濃度FSH對卵巢顆粒細胞中ZP3 表達的影響Fig.8 Effects of FSH with different concentrations on the expression of ZP3 in ovarian granulosa cells

3 討 論

透明帶蛋白在哺乳動物中有著很高的保守性，但是在非哺乳動物中的研究較少。有研究表明，在小鼠及爪蟾中ZP3誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，從而阻止多精受精。在對萍鄉(xiāng)紅鯽的研究中發(fā)現(xiàn)，精子和卵子相遇需要一套穩(wěn)定的機制，使精子能夠迅速準確地進入卵子[20]。而ZP3就是其中的一個識別因子，在與精子結(jié)合后，ZP3被修飾而不再具有精子受體活性和頂體反應(yīng)誘導(dǎo)作用[21]。因此，在非哺乳動物中ZP3同樣起到阻止多精受精的作用。在傳統(tǒng)家禽育種中，產(chǎn)蛋率和受精率在很大程度上影響了育種的成本，而如何從分子機制上提高產(chǎn)蛋率和受精率成為了育種的新方向。

目前ZP3的研究主要集中在精卵結(jié)合方面，有研究證明，在哺乳動物如人和鼠上，ZP3蛋白主要在卵巢組織表達[22]，但在家禽上的研究較少，家禽原始卵泡的發(fā)育起始于卵泡顆粒細胞分泌的細胞因子，促進卵母細胞生長，家禽的卵泡結(jié)構(gòu)主要有卵黃膜層、顆粒細胞層、卵泡膜內(nèi)層、卵泡膜外層雞外周組織層[23]，其中卵泡顆粒細胞在卵泡生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[24]，顆粒細胞與膜細胞之間的互作機制是卵巢雌激素形成的基礎(chǔ)[25]。在卵泡發(fā)育過程中，F(xiàn)SH可以促進發(fā)育差的卵泡再次發(fā)育[26]，在小鼠模型中，敲除FSH受體可顯著抑制卵泡生成，敲除ZP3會使小鼠卵母細胞發(fā)育失常[27]，因此FSH和ZP3之間可能存在互作機制，同時 FSH還可以促進雌二醇分泌，以及通過促進抗凋亡蛋白(如XIAP蛋白和FLIP抑制蛋白)的表達來抑制細胞凋亡[28]，雌二醇又可以與顆粒細胞內(nèi)受體結(jié)合形成復(fù)合物通過抑制P53信號通路和相關(guān)蛋白進而抑制凋亡[29]，同時雌二醇還可以通過TGF-α影響XIAP進而促進顆粒細胞增殖[30]。對哺乳動物的大量研究表明，顆粒細胞產(chǎn)生的孕酮可以反作用于卵泡顆粒細胞并抑制其凋亡，而顆粒細胞的凋亡是卵泡閉鎖的根本原因[31]，卵泡閉鎖與產(chǎn)蛋量緊密相關(guān)，減少卵泡的閉鎖在一定程度上可以提高產(chǎn)蛋量。

4 結(jié) 論

本試驗獲得的ZP3全長為1 415 bp，其中編碼區(qū)1 341 bp；通過對海蘭褐蛋雞ZP3進行組織表達譜分析表明，基因在卵巢中表達量最高，通過構(gòu)建不同發(fā)育階段卵泡的表達譜，發(fā)現(xiàn)ZP3隨著卵泡發(fā)育，在成熟卵泡中表達量最高，在顆粒細胞層表達量逐漸增加；在FSH處理顆粒細胞后，發(fā)現(xiàn)ZP3表達量顯著上調(diào)，本試驗證明FSH可以促進ZP3表達量的增加。基于以上結(jié)果推測，ZP3可能參與調(diào)控雞的產(chǎn)蛋過程，但FSH-顆粒細胞-ZP3之間的具體調(diào)控機制還需后續(xù)研究。