孫遠(yuǎn)昆 郭良浩 王凱程 王少萌 宮玉彬

(電子科技大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院(示范性微電子學(xué)院)，微波電真空器件國家級重點實驗室，成都 610054)

鉀離子通道在神經(jīng)細(xì)胞動作電位復(fù)極過程中起著重要作用.鉀離子通道蛋白種類繁多，鉀離子通道允許鉀離子特異性穿過細(xì)胞膜，從而維持神經(jīng)細(xì)胞靜息電位.離子通道蛋白的二級結(jié)構(gòu)決定其功能特性，皮秒尺度內(nèi)二級結(jié)構(gòu)的波動會對離子通道蛋白的功能，即離子通過速率有很大的影響.本文使用分子動力學(xué)模擬方法，模擬施加不同幅值的53.7 THz 的太赫茲波對真實KcsA 鉀通道蛋白二級結(jié)構(gòu)和鉀離子通過速率的影響.研究發(fā)現(xiàn)，在53.7 THz 的太赫茲波的作用下，KcsA 鉀通道蛋白中α 螺旋數(shù)量減少，β 折疊以及卷曲數(shù)量增加.此外，53.7 THz 的太赫茲波能夠加速鉀離子通過KcsA 鉀通道.本文從蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析太赫茲波對鉀離子通道蛋白的影響，為太赫茲波和生物功能分子相互作用之間提供了新的觀察角度.

1 引言

鉀離子通道廣泛分布于神經(jīng)、血管、血液等的細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞，尤其是神經(jīng)細(xì)胞的膜電位和興奮性中起重要作用[1-4].電壓門控K+通道是典型的電壓門控通道，是最大的鉀通道基因家族，是神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5-7].人體中的電壓門控鉀離子通道包括40 個不同的基因編碼，分為12 個亞科，從Kv1 到Kv12.哺乳動物電壓門控鉀通道是由圍繞離子傳導(dǎo)孔的4 個相同α 亞基組成的四聚體結(jié)構(gòu)，其中每個亞基有6 個α 螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域(S1—S6)，選擇性過濾器由S5 和S6 之間的回路形成，其中S1—S4 序列對于通道電壓感應(yīng)和門控至關(guān)重要[5].

太赫茲波對研究生物系統(tǒng)的重要性在于其頻率對應(yīng)于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)等生物功能分子的構(gòu)象振蕩范圍，以及其量子能量與氫鍵和范德瓦耳斯力等分子間相互作用的能量重合，作用于生物分子上的太赫茲波和生物分子內(nèi)部可能發(fā)生非線性共振，導(dǎo)致其構(gòu)象和功能發(fā)生劇烈變化，從而對生物系統(tǒng)產(chǎn)生非熱效應(yīng)[8-13].因此，太赫茲波有望具有廣泛的潛在生物醫(yī)學(xué)和安全相關(guān)應(yīng)用.已有研究表明，太赫茲波和細(xì)胞內(nèi)移動離子的相互作用主要是電作用[14].太赫茲波能夠影響膜蛋白的功能從而對生理過程進(jìn)行調(diào)制.研究發(fā)現(xiàn)，太赫茲波通過和離子通道蛋白某些基團(tuán)形成共振，影響離子通過速率，進(jìn)而影響生物體的記憶以及感知等功能[15-18].太赫茲波還可通過引起堿性磷酸酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而影響其活性[19].太赫茲波會引發(fā)各種細(xì)胞反應(yīng)，例如改變基因表達(dá)模式、改變基因組的結(jié)構(gòu)和完整性以及影響細(xì)胞骨架的組裝過程[20-22].近年來，有研究報道了太赫茲波對細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的影響.太赫茲波能夠通過與弱氫鍵相連的嘌呤振動之間形成共振，破壞堿基對之間的氫鍵，從而大大加速DNA 的解螺旋速度[23].太赫茲波還可通過影響細(xì)胞內(nèi)Zn2+離子的局部濃度變化來影響基因表達(dá)[24].上述研究表明，具有特定頻率的太赫茲波會對生物功能分子產(chǎn)生影響，分布在細(xì)胞膜上的離子通道蛋白是太赫茲波的潛在分子靶標(biāo).此外，在模擬太赫茲波對生物功能分子的調(diào)制過程中，大多使用僅包含主要基團(tuán)的近似結(jié)構(gòu)，且對太赫茲波作用過程中離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化知之甚少.本文采用分子動力學(xué)方法，模擬太赫茲波對真實鉀離子通道的作用，并分析在此過程中鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，從而為太赫茲波和鉀離子通道蛋白作用的動力學(xué)關(guān)系提供新的視角.

本文分析了太赫茲波對鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，計算不同幅值太赫茲波作用下鉀離子通道蛋白氫鍵網(wǎng)絡(luò)的變化，以研究太赫茲波對蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵的影響.此外，計算了不同幅值太赫茲波作用下鉀離子通道蛋白各種二級結(jié)構(gòu)的數(shù)目，統(tǒng)計分析太赫茲波對各種二級結(jié)構(gòu)的變化趨勢的影響，結(jié)果表明，太赫茲波對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響主要體現(xiàn)在α 螺旋、β 折疊和卷曲這3 種二級結(jié)構(gòu).最后，計算了不同幅值太赫茲波作用下，鉀離子通過鉀離子通道的速率.

2 鉀離子通道蛋白四聚體結(jié)構(gòu)模型與分子動力學(xué)計算方法

2.1 鉀離子通道蛋白四聚體結(jié)構(gòu)

從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(RCSB PDB)中獲得鉀離子通道蛋白KcsA 的單體結(jié)構(gòu)，并使用VMD 將其轉(zhuǎn)化成四聚體結(jié)構(gòu).在計算前，用CHARMMGUI網(wǎng)站補(bǔ)全原始結(jié)構(gòu)中缺失的殘基，并用VMD 檢查補(bǔ)齊后的四聚體結(jié)構(gòu).如圖1(a)所示，KcsA 通道結(jié)構(gòu)包含1 個胞內(nèi)門，將細(xì)胞質(zhì)和充滿水的空腔分開，這個門是由4 個TM2 螺旋的羰基末端聚集在一起形成束交叉從而收縮通往孔道區(qū)的通道.圖1(b)是從正前方觀察到的KcsA 通道結(jié)構(gòu)，圖中黃顏色為β 折疊，紫色為α 螺旋，β 折疊和α 螺旋之間通過卷曲連接.

2.2 分子動力學(xué)模擬體系的構(gòu)建

如圖1(c)所示，將鉀離子通道蛋白的四聚體結(jié)構(gòu)正確嵌入二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)膜中，并用SPC 水填充整個盒子[25].為了模擬真實的生理環(huán)境，在模擬體系中加入0.15 mmol 的KCl，對應(yīng)于模擬體系中含有315 個K+和331 個Cl—.為了充分限制蛋白質(zhì)和磷脂的位置，在模擬之前，先進(jìn)行400 ps 的預(yù)平衡.之前的研究表明，鉀離子通道中負(fù)責(zé)鉀離子特異性傳輸?shù)幕鶊F(tuán)是羰基，羰基自發(fā)的振動頻率為53.7 THz[16].因此，在模擬盒子中應(yīng)用53.7 THz 的太赫茲波從上表面垂直入射，模擬的時間步長為2 fs.

從圖1(a)和圖1(b)可以看到，KcsA 過濾器有向內(nèi)朝向孔中心的骨架羰基氧，以協(xié)調(diào)通過的鉀離子，從而取代它們的溶劑化水.已有研究表明，鉀離子通道的孔區(qū)域通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)固定在恰當(dāng)?shù)奈恢肹26].

圖1 (a) KcsA 四聚體結(jié)構(gòu)(從上往下);(b) KcsA 四聚體結(jié)構(gòu)(從前往后);(c)鉀離子通道模型Fig.1.(a) KcsA tetramer structure (from top to bottom);(b) KcsA tetramer structure (from front to back);(c) potassium channel model.

蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)與溶劑分子之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)波動通過平均氫鍵對的相關(guān)函數(shù)[Chb(τ) ]來表征[27]:

式中t時刻特定氫鍵i的存在函數(shù)是0 或1 (hb(τ)[0，1]).在分析中，氫鍵是使用幾何標(biāo)準(zhǔn)定義的，即質(zhì)心距離小于3.5 ?，O···H 的距離小于2.6 ?，HO和O 之間的角度小于30°.蛋白質(zhì)系統(tǒng)中其他弱相互作用(范德瓦耳斯力、靜電等)被識別為近似截止距離內(nèi)的接觸.

二級結(jié)構(gòu)，如α 螺旋和β 折疊，是以骨架氫鍵、骨架原子、Cα 原子等連接[26].氫鍵和任何分子相互作用一樣，在短距離內(nèi)很強(qiáng)并在無窮遠(yuǎn)處不斷減小為零.為了計算方便，氫鍵被視為階躍函數(shù).氫鍵的判定標(biāo)準(zhǔn)有能量準(zhǔn)則、電子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)則、幾何準(zhǔn)則等，其中能量準(zhǔn)則和電子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)則的計算量大，不易實現(xiàn)[27].在本文的計算中，使用幾何標(biāo)準(zhǔn)對氫鍵進(jìn)行定義，氫鍵是由氫原子-施體-受體所成角度的截斷值與施體-受體之間距離的截斷值共同決定的.OH 和NH 被作為氫鍵施體，O 總是作為氫鍵受體，N 默認(rèn)為受體，以便對KcsA 四聚體中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和各種二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分.

3 不同強(qiáng)度太赫茲波對體系氫鍵網(wǎng)絡(luò)的影響

鉀離子通道蛋白質(zhì)在脂質(zhì)膜的復(fù)雜環(huán)境中起作用，蛋白質(zhì)原子不僅彼此相互作用并與水相互作用，還和周圍脂質(zhì)分子的原子相互作用.氫鍵可在蛋白質(zhì)中氨基酸的殘基內(nèi)起作用，是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和靈活性的驅(qū)動力之一，對于膜蛋白的組裝、結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[28].天然膜環(huán)境中的膜蛋白不像在晶體結(jié)構(gòu)中所觀察到的是靜態(tài)的，相反，它們是動態(tài)的.理論和實驗的研究結(jié)果都表明，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中發(fā)生的皮秒時間尺度的波動對蛋白質(zhì)的功能有很大影響[29-31].分子動力學(xué)模擬允許我們通過重建溶劑化膜蛋白的生理脂質(zhì)膜環(huán)境擴(kuò)展實驗的觀察范圍，從而研究原子細(xì)節(jié)的動力學(xué)[32].計算了不同幅值的太赫茲波輻射下鉀離子通道蛋白氫鍵網(wǎng)絡(luò)中氫鍵的數(shù)量，結(jié)果如圖2 所示.可以看出:隨著時間的增加，氫鍵數(shù)量開始緩慢增加，經(jīng)過800 ps 后，氫鍵數(shù)量趨于穩(wěn)定.隨著太赫茲波幅值從0 增加到0.5 V/nm，穩(wěn)定后的氫鍵網(wǎng)絡(luò)中的氫鍵數(shù)量在減少，且隨著幅值的增大，減少趨勢越來越明顯，下文也可以得出氫鍵數(shù)量的改變主要是由鉀通道蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)的數(shù)目變化引起的，氫鍵的數(shù)量對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要作用，氫鍵數(shù)量減少說明此時蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性變?nèi)?，鉀離子通道蛋白的構(gòu)象容易發(fā)生改變，進(jìn)而影響通道中鉀離子通過速率.

圖2 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通道蛋白中氫鍵的變化Fig.2.Changes of hydrogen bonds in potassium channel proteins at different terahertz intensities.

4 不同強(qiáng)度太赫茲波對鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

二級結(jié)構(gòu)允許簡單描述蛋白質(zhì)的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu).分子動力學(xué)軟件Gromacs 采用DSSP 程序?qū)⑼ㄟ^X 射線晶體學(xué)或核磁共振確定的原子坐標(biāo)轉(zhuǎn)換為供體和受體之間的主鏈氫鍵，然后將重復(fù)鍵合模式轉(zhuǎn)換為螺旋、片和匝等類別，進(jìn)一步可細(xì)分為α 螺旋、卷曲、β 折疊、β 橋、彎曲、轉(zhuǎn)角、回折等二級結(jié)構(gòu).本文計算了在不同幅值太赫茲波作用下鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)(總數(shù)=α 螺旋+β 折疊 +β 橋+轉(zhuǎn)角)的變化趨勢.如圖3 所示，在經(jīng)過近700 ps 的穩(wěn)定后，鉀離子通道蛋白的二級結(jié)構(gòu)數(shù)目也趨于穩(wěn)定，從圖3 可以看出，當(dāng)外加太赫茲波時，鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)數(shù)目比不加太赫茲電磁波時多，外加太赫茲電磁波會影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化從而影響其功能.并且在外加太赫茲波幅值為0.2 V/nm 時，鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的數(shù)目增加最多，此時我們認(rèn)為是鉀離子通道蛋白和太赫茲波形成頻率和幅值匹配才造成鉀離子通道蛋白結(jié)構(gòu)變化顯著.

圖3 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通道蛋白中二級結(jié)構(gòu)數(shù)目的變化Fig.3.Changes in the number of secondary structures in potassium channel proteins under different terahertz intensities.

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)又可進(jìn)一步分為α 螺旋、β 折疊、卷曲和轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu).α 螺旋是蛋白質(zhì)肽鏈主鏈骨架借助氫鍵卷曲形成的一種周期性螺旋結(jié)構(gòu)，α 螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域的相互作用和動力學(xué)在膜蛋白的折疊、組裝和功能中起著重要作用[33-35].氫鍵是α 螺旋穩(wěn)定的主要次級鍵，當(dāng)氫鍵破壞時，α 螺旋構(gòu)象即被破壞.借助VMD，我們發(fā)現(xiàn)α 螺旋主要集中于S5 和S6 的孔道處，即包圍了鉀離子通道最窄的地方.不同幅值的太赫茲波作用下α 螺旋的變化趨勢如圖4 所示，可以看出，在體系平衡后，外加太赫茲波時，鉀離子通道蛋白中α 螺旋的數(shù)目要比未加太赫茲波時少，并且外加太赫茲波的幅值增大時，對應(yīng)的α 螺旋的數(shù)目也在緩慢減小.因為太赫茲波的能量極低，不能直接破壞共價鍵，只能通過共振形式破壞氫鍵.圖4 中的結(jié)果表明，太赫茲波會破壞鉀離子通道蛋白中α 螺旋中的氫鍵，使其數(shù)目減少.

圖4 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通道蛋白中α 螺旋數(shù)目的變化Fig.4.Changes in the number of α-helices in potassium channel protein under different terahertz intensities.

β 折疊是由兩條以上肽鏈或同一條肽鏈之間的不同部分平行或反平行排列形成股，股與股之間通過氫鍵固定，氫鍵主要在股間.β 折疊主要存在于S1—S4 序列，影響通道電壓感應(yīng)和門控.不同幅值的太赫茲波作用下β 折疊的變化趨勢如圖5所示，可以看出，外加太赫茲波時的β 折疊數(shù)量比未加太赫茲波時多.說明太赫茲波可能會促進(jìn)不同肽鏈之間或同一條肽鏈之間不同部分形成新的β 折疊，也有可能是太赫茲波導(dǎo)致部分α 螺旋展開形成β 折疊.從圖4 和圖5 可知，太赫茲波造成α 螺旋減少，β 折疊增多.β 折疊往往含有較多的非極性殘基，并埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成疏水核心，而α 螺旋通常是兩性的，親水面位于表面，疏水一側(cè)朝向蛋白質(zhì)內(nèi)部.α 螺旋的減少和β 折疊的增多會導(dǎo)致鉀離子通道中疏水核的暴露和親水面的減少，從而影響鉀離子通過速率.

圖5 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通道蛋白中β 折疊數(shù)目的變化Fig.5.Changes in the number of β-sheet in potassium channel protein under different terahertz intensities.

卷曲通過主鏈間的氫鍵或主鏈與側(cè)鏈間的氫鍵穩(wěn)定其構(gòu)象，其是柔性的，可以使肽鏈改變走向，且有利于連接結(jié)構(gòu)相對剛性的α 螺旋和β 折疊.從圖6 可以看出，外加太赫茲波時鉀離子通道蛋白中的卷曲數(shù)目減少，并且在外加太赫茲波幅值為0.2 V/nm 時，卷曲的數(shù)目變化最大，此時蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化可能最大.

圖6 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通道蛋白中卷曲數(shù)目的變化Fig.6.Changes in the number of coil in potassium channel protein under different terahertz intensities.

5 不同強(qiáng)度太赫茲波對離子通過速率的影響

鉀離子通過鉀通道的速率對于調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的靜息電位和動作電位至關(guān)重要，并且鉀離子通道對一些疾病起著調(diào)節(jié)作用，是治療的新靶點.本文分別計算了無太赫茲電場、太赫茲電場強(qiáng)度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 V/nm 情況下鉀離子通過電壓門控鉀離子通道的速率，從圖7 可知，最開始隨著外加太赫茲波幅值的增大，鉀離子通過鉀離子通道的速率也隨之增大，但是當(dāng)幅值增加到0.3 V/nm 及以上時，鉀離子通過的速率不再增加，我們推測已經(jīng)達(dá)到了鉀離子通道的飽和，這是由于孔道蛋白分子不是電中性的，其對通過的鉀離子具有一定的電吸引，限定了它的最大運(yùn)輸速度.并且從圖4—圖6可知，當(dāng)外加太赫茲波的幅值為0.2 V/nm 時，對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)變化最大，但是此時的鉀離子通過速率卻沒有達(dá)到最大.靜電分析表明，當(dāng)鉀離子沿著狹窄的孔道穿過膜時它必須穿過一個能量閘，太赫茲波除了和鉀離子通道蛋白中的羰基形成共振外，還對模擬盒子中的鉀離子有庫侖力的作用，兩者共同作用使鉀離子快速通過鉀離子通道.

圖7 太赫茲波強(qiáng)度不同時鉀離子通過鉀離子通道的數(shù)目Fig.7.Number of potassium ions passing through potassium channels under different intensities of terahertz.

6 結(jié)論

本文采用分子動力學(xué)的方法模擬了太赫茲波對真實鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，以及太赫茲波對鉀離子通過鉀離子通道的影響.基于DSSP程序，統(tǒng)計了在不同幅值太赫茲波的作用下，鉀離子通道蛋白主要二級結(jié)構(gòu)皮秒時間尺度隨時間的波動.結(jié)果表明，太赫茲波的作用下，α 螺旋的數(shù)目減少，β 折疊、卷曲等二級結(jié)構(gòu)的數(shù)目有小幅增加.特別是卷曲數(shù)目的改變表明了鉀離子通道蛋白構(gòu)象在太赫茲作用下發(fā)生了改變.太赫茲波還能夠促進(jìn)鉀離子通過鉀離子通道.開始階段隨著外加太赫茲波幅值的增加，鉀離子通過速率也跟著增加，當(dāng)增加到0.3 V/nm 及以上時，鉀離子的通過速率不再變化，這主要是由于已經(jīng)達(dá)到了鉀離子通道的飽和.本文的研究為理解太赫茲波和離子通道蛋白集體振動的關(guān)系提供了一個新的視角.