王曉寒，葉云林，肖康華，趙志鑫，吳靜雅

1. 河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院外科教研室，安陽 455000；2. 中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿腫瘤科，廣州 510030；3. 河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)教研室，安陽 455000；4.河南省安陽地區(qū)醫(yī)院中醫(yī)科，安陽 455000

膀胱癌是人類最常見的泌尿系統(tǒng)癌癥之一，如果不進(jìn)行有效治療，發(fā)病率和死亡率很高［1］。淺表性膀胱癌約占膀胱癌的75%，其中50%以上的患者有腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展［2］。此外，只有46%的Ⅲ期患者和15%的Ⅳ期患者能達(dá)到5 年生存率［3］。雖然使用了大量的治療方法，如手術(shù)、放射治療（放療）、化學(xué)治療（化療）等，但膀胱癌的術(shù)后生存率仍然很低［4］。T細(xì)胞的活化依賴于雙信號：一是抗原肽-MHC 復(fù)合物，由T 細(xì)胞抗原受體識別；二是共刺激信號（co-stimulating signal），影響T細(xì)胞的活化、增殖及細(xì)胞因子分泌［5-6］。B7家族是重要的共刺激分子，家族成員之一的B7-H3蛋白，也被稱為CD276，包括1個N 端信號肽、IgV 樣區(qū)、1個IgC樣區(qū)、1個跨膜區(qū)和1個45個氨基酸的胞漿尾［7］。它在多種癌癥中都有高表達(dá)，并已被證明能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［8-11］。已有相關(guān)研究報道，B7-H3過表達(dá)可通過PI3K/Akt/STAT3信號通路促進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲［12］，B7-H3在肌肉浸潤性膀胱癌組織中的高表達(dá)水平與不良的臨床病理狀態(tài)和不良的預(yù)后有關(guān)［13］，但幾乎未見報道B7-H3對膀胱癌干細(xì)胞特性的影響。因此本研究重點考察B7-H3對膀胱癌J82細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2018 年9 月—2019 年12月期間手術(shù)切除的17例膀胱癌組織和癌旁組織作為樣本。所有臨床組織標(biāo)本均由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科免疫組化結(jié)果確認(rèn)為癌組織或正常上皮組織。本研究通過中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查會審核，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

正常人膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞系（J82，T24，5637 及BIU-87）購于武漢Procell 公司；GV248 干擾載體購于中國吉凱基因公司； Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶、抗體Bcl-2（#13-8800，1 μg/mL）、20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子、2%B27、F12 培養(yǎng)基購于美國Invitrogen 公司；RNA purification system 購于德國Qiagen 公司；DNase-I 購于瑞士Roche 公司；隨機(jī)六聚體購于美國Sigma-Aldrich 公司；Giemsa 染色液、胰蛋白酶、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、1%結(jié)晶紫、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；抗體Bax（#2772，1∶1 000）、GAPDH（#97166， 1∶1 000）、 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（#2463，1∶1 000）、波形蛋白（Vimentin）（#39325，1∶1 000）、性別決定區(qū)Y 框蛋白2（SRY-related high-mobility-group box gene 2，SOX2）（#2748，1∶1 000）、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（octamer binding transcription factor 4，OCT4）（#2750，1∶1 000）、抗兔IgG（#7074，1∶2 000）和抗生物素的HRP 連接抗體（#7074，1∶1 000）購于美國CST 公司；表皮生長因子、DMEM 購于美國Sigma 公司。ABI Prism 7000 系統(tǒng)購于美國Applied Biosystems 公司；SYBR Green Master Mix購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人膀胱上皮細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞保存于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 B7-H3基因干擾實驗

本研究中選擇3 組shRNA——shRNA1、shRNA2、shRNA3 用來干擾B7-H3基因。B7-H3-shRNAs 是針對B7-H3基因設(shè)計的（NM_001024736.2）；采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測干擾效率。將特異性shRNAs克隆到GV248 干擾載體（中國吉凱基因公司）中。綠色熒光蛋白（GFP）慢病毒載體作為陰性對照。Control 組不做處理，其余各組通過Lipofectamine?2000 將陰性質(zhì)粒載體及B7-H3干擾質(zhì)粒shRNA1、shRNA2、shRNA3轉(zhuǎn)染至J82細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集并濃縮含有慢病毒的細(xì)胞上清液，校準(zhǔn)病毒效價，最后得到對照細(xì)胞、shRNA-NC細(xì)胞、B7-H3-shRNA1 細(xì)胞、B7-H3-shRNA2 細(xì)胞和B7-H3-shRNA3細(xì)胞。慢病毒的最終濃度為4×108TU/mL，儲存于-80 ℃。

1.5 qRT-PCR實驗

總RNA 用RNA purification system 提取。用DNase-I去除基因組DNA。用Superscript RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體從5 mg 總RNA 中制備cDNA。對于qRT-PCR，在ABI Prism 7000 系統(tǒng)中，使用SYBR Green Master Mix 和引物在優(yōu)化濃度下測定基因表達(dá)。B7-H3和管家基因甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）的序列如下：B7-H3正向引物5'-CATCACACCCCAGAGAAGCC-3'，反向引物5'-AGA GGGCCGTGCGGTTGGCA-3'；GAPDH正向引物5'-G GGTGTGAACCACGAGAAAT-3'，反向引物5'-ACTGT GGTCATGAGCCCTTC-3'。每個基因均生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達(dá)的相對定量。所有結(jié)果均以GAPDH為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化。

1.6 克隆形成實驗

將對照組、shRNA-NC組及B7-H3-shRNA組的J82細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔200 個細(xì)胞，連續(xù)接種7 d。廢棄培養(yǎng)基，每個孔用PBS仔細(xì)洗2次。將菌落在甲醇中固定20 min，然后用Giemsa 染色液染色。統(tǒng)計≥50 個細(xì)胞的菌落數(shù)，計算菌落形成效率：菌落百分比=菌落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

用胰蛋白酶消化J82細(xì)胞，用70%乙醇在4 ℃下過夜固定細(xì)胞。然后加入10 mg/mL RnaseA（上海翊圣生物科技有限公司）和碘化丙啶（propidi iodide，PI，北京索萊寶科技有限公司）于4 ℃染色過夜。使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）按照說明書使用流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司，美國）檢測細(xì)胞凋亡率。AnnexinV-FITC（-）/PI（-）（左下）為正常細(xì)胞，AnnexinV-FITC （+）/PI（-）細(xì)胞（右下）為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC（+）/PI（+）（右上）為晚期凋亡細(xì)胞。AnnexinV（-）/PI（+）（左上）為壞死細(xì)胞。

1.8 Transwell實驗

J82 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，接種于含10%胎牛血清（Gibco 公司，美國）的培養(yǎng)基中，細(xì)胞數(shù)為3×104個/孔。培養(yǎng)24 h 后，用棉簽將上層殘留的細(xì)胞取出。遷移后的細(xì)胞在室溫下用95%乙醇固定，然后用1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察每個孔的5個隨機(jī)區(qū)域的染色情況。

1.9 腫瘤成球?qū)嶒?/h3>

細(xì)胞計數(shù)后，將單個細(xì)胞鋪板在60 mm 無包被培養(yǎng)皿中（2.5×105/皿）檢查球體形態(tài)，使用96 孔超低聚類板（2.5×104/孔）計數(shù)腫瘤球。在含有20 ng/mL 表皮生長因子、10 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長因子和2%B27 的無血清DMEM 和F12培養(yǎng)基中增殖細(xì)胞。培養(yǎng)7 d后于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀測。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）

用10%SDS-PAGE分離細(xì)胞和腫瘤中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶阻斷后，蛋白質(zhì)與第一抗體在4 ℃下孵育過夜。主要抗體如下：B7-H3（#ab105922，1∶1 000，Abcam 公司，英國）、Bax、Bcl-2、GAPDH、VEGF、Vimentin、SOX2和OCT4。PBS洗滌，抗兔IgG和抗生物素的HRP連接抗體孵育1 h。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）觀察這些條帶。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

以上實驗均獨立重復(fù)3 次。所有定性資料均采用x±s表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.5 進(jìn)行統(tǒng)計分析；多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B7-H3在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞系中高表達(dá)

RT-qPCR 檢測B7-H3在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)。如圖1A 所示，與癌旁組織比較，膀胱癌組織中的B7-H3mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（t=3.041，P=0.000）。如圖1B 所示，與正常人膀胱上皮細(xì)胞比較，膀胱癌5637、J82、T24 及BIU-87 細(xì)胞系中的B7-H3mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)（t=10.600、 2.882、 4.310、 5.364， 均P=0.000），且在J82 細(xì)胞系中上調(diào)最顯著，因此使用J82進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 B7-H3在膀胱癌組織和膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 Expression of B7-H3 in bladder cancer tissues and bladder cancer cell lines

2.2 B7-H3-shRNAs轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞J82的效率

本研究中， 3 組shRNA——shRNA1、 shRNA2、shRNA3轉(zhuǎn)染J82細(xì)胞后，RT-PCR和Western Blotting檢測B7-H3基因的表達(dá)。結(jié)果（圖2）顯示，與對照組相比，3個shRNAs 組均顯著降低了B7-H3的mRNA 和蛋白表達(dá)水平（mRNA 水平：t=1.667、1.128、2.571，均P=0.000；蛋白水平：t=1.533、1.073、1.780，均P=0.000），其中shRNA2干擾效果最為明顯，因此選用shRNA2用于后續(xù)實驗。

圖2 膀胱癌細(xì)胞J82轉(zhuǎn)染3種shRNAs后對B7-H3干擾效率的檢測Fig 2 Detection of B7-H3 interference efficiency of bladder cancer cells J82 transfected with the three shRNAs

2.3 B7-H3-shRNA2抑制J82細(xì)胞增殖

克隆形成實驗的結(jié)果（圖3）展示，B7-H3-shRNA組的克隆形成率顯著低于對照組（t=1.526，P=0.000）。由此表明，shRNA2 沉默B7-H3 能抑制J82 細(xì)胞的生長。

圖3 J82細(xì)胞增殖情況的檢測Fig 3 Detection of J82 cells proliferation

2.4 B7-H3-shRNA2促進(jìn)J82細(xì)胞凋亡

如圖4所示，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。數(shù)據(jù)表明，相較于對照組，B7-H3-shRNA 組的細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=1.281，P=0.000）。同時Western blotting 實驗的結(jié)果進(jìn)一步從蛋白水平證實，與對照組比較，B7-H3-shRNA 組凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 比例顯著增大（t=1.025，P=0.000）。上述實驗均說明shRNA2 干擾B7-H3促進(jìn)了J82細(xì)胞的凋亡。

圖4 J82細(xì)胞的凋亡情況的檢測Fig 4 Detection of apoptosis of J82 cells

2.5 B7-H3-shRNA2抑制J82細(xì)胞侵襲

如圖5A 所示，Transwell實驗結(jié)果表明，與對照組相比，B7-H3-shRNA 組的侵襲細(xì)胞顯著降低（t=1.436，P=0.000）。同樣，Western blotting 從蛋白水平證實了B7-H3-shRNA 組VEGF 和Vimentin 的表達(dá)量相較于對照組均明顯降低（t=1.138、1.122，P=0.000）（圖5B）。這些實驗都證實了B7-H3基因的敲除可阻礙J82細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 J82細(xì)胞侵襲情況Fig 5 Invasion of J82 cells

2.6 B7-H3-shRNA2抑制J82細(xì)胞干細(xì)胞樣特性

腫瘤成球?qū)嶒烇@示，相較于對照組，B7-H3-shRNA2組腫瘤球的直徑明顯縮?。╰=1.839，P=0.000）（圖6A、B）； 且B7-H3-shRNA2 組腫瘤球克隆數(shù)量顯減少（t=1.875，P=0.000）（圖6A、C）。Western blotting檢測結(jié)果表明，B7-H3-shRNA2組與對照組比較，其干細(xì)胞標(biāo)記物SOX2 和OCT4 的表達(dá)顯著降低（t=1.444、1.123，P=0.000）。進(jìn)而證實了B7-H3基因干擾可削弱J82 細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性。

圖6 J82細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性Fig 6 Stemness characteristics of J82 cells

3 討論

B7- H3 是B7 家族免疫調(diào)節(jié)蛋白的一員，B7-H3mRNA 在正常人體組織中廣泛表達(dá)，但B7-H3 蛋白表達(dá)水平較低，說明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控較強(qiáng)。相比之下，B7-H3蛋白在許多類型的惡性腫瘤中過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和耐藥。B7-H3 可作為有潛力的生物標(biāo)志物和治療靶點［14］。

敲除B7-H3的表達(dá)或抑制B7-H3可降低多種類型癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長。此外，B7-H3的表達(dá)水平會影響癌細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。越來越多的研究支持B7-H3在不同類型的癌癥中發(fā)揮促癌作用。Zhong 等［15］的結(jié)果表明，B7-H3過表達(dá)可通過JAK2/STAT3/Slug 依賴的信號通路抑制膠質(zhì)瘤生長，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。Kang 等［9］的研究證實，B7-H3通過JAK2/STAT3/Slug 信號通路靶向上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和侵襲性。Wang等［16］報道，B7-H3在骨肉瘤患者中過表達(dá)，并與腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Li 等［17］的研究顯示，B7-H3通過向胰腺癌細(xì)胞傳遞信號來對抗化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究使用shRNA抑制B7-H3在膀胱癌J82細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果揭示表達(dá)下調(diào)的B7-H3抑制了J82 細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲，并促進(jìn)凋亡。結(jié)果與之前的研究一致。

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是一小群保留干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮著重要作用。CSCs 的自我更新和分化負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生和維持。CSCs 在轉(zhuǎn)移過程中也起致瘤細(xì)胞的作用。此外，CSCs對抗癌藥物具有耐藥性，治療后殘留的CSCs會導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。由于CSCs 在腫瘤的發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)等方面具有顯著的作用，通過靶向調(diào)控CSCs 的信號通路抑制CSCs 是一種有效的抗肺癌策略［18-20］。B7-H3對CSCs 影響的相關(guān)報道很少。Liu 等［21］的數(shù)據(jù)顯示，B7-H3的上調(diào)增加了乳腺癌干細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)了癌癥的發(fā)展。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制表達(dá)的B7-H3減少了膀胱癌J82 細(xì)胞的腫瘤球大小及數(shù)量，且下調(diào)了干細(xì)胞標(biāo)記蛋白SOX2和OTC4表達(dá)。此結(jié)果與Li等在乳腺癌中的研究是一致的。

綜上所述，下調(diào)B7-H3的表達(dá)，可抑制膀胱癌J82 細(xì)胞的惡性增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且可阻礙J82細(xì)胞干細(xì)胞樣特性。