張欣 楊樹 茍攀寧 薛應鈺

（甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅蘭州 730070）

在設施蔬菜生產(chǎn)中，連作重茬現(xiàn)象日益嚴重，南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）對蔬菜的危害逐年加重（李周容 等，2020；Victor et al.，2021），每年有30%的設施蔬菜受到南方根結(jié)線蟲的侵染，造成產(chǎn)量損失20%～40%（Cao et al.，2014）。根結(jié)線蟲已成為嚴重影響設施蔬菜產(chǎn)量的重要因素（劉曉宇 等，2020）。噻唑膦是常用的有機磷類殺線蟲劑，具有很強的觸殺作用，對根結(jié)線蟲具有明顯的防治效果（馬濤 等，2017）。但頻繁大量的使用會造成根結(jié)線蟲抗藥性增加（王泊理和趙江克，2019）。近年來有關(guān)生防放線菌防治南方根結(jié)線蟲的研究已成為主要趨勢（任玉鵬，2016；Bansa et al.，2020）。研究表明，從根結(jié)線蟲卵上分離的紅灰鏈霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47 具有殺線蟲活性和卵孵化抑制作用，并可增加番茄產(chǎn)量（Jin et al.，2017）；海洋白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）HA10002 和金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）DA09202 對根結(jié)線蟲有拮抗作用（曾慶飛，2011）；通過將化學農(nóng)藥與生物制劑復配的方式來防治南方根結(jié)線蟲，既可以提高防治效率，還可以降低化學農(nóng)藥的用量（王文朝，2016）。

婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）ZZ-9 是由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病害生物防治實驗室前期分離保存的一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生防放線菌（范萬澤 等，2017），謝玉琴等（2019）發(fā)現(xiàn)放線菌ZZ-9菌株發(fā)酵液對小麥幼苗具有促生作用。

本試驗通過研究不同比例的噻唑膦和婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 復配以后對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的殺線活性，以期減少化學農(nóng)藥的使用量并延緩根結(jié)線蟲的抗藥性，為蔬菜根結(jié)線蟲的防治提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 菌株（專利保存號：CGMCCNo.15245）由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物病害生物防治實驗室分離保存。

1.1.2 供試藥劑 20%噻唑膦水乳劑（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）。

1.1.3 供試土樣 2017 年7月采自甘肅省蘭州市榆中縣南方根結(jié)線蟲發(fā)生較嚴重的地塊，采用五點取樣法取5～20 cm 土層的土壤，破碎后裝入自封袋，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 供試培養(yǎng)基 高氏合成1號（gauserime synthetic agar）培養(yǎng)基，小米浸汁培養(yǎng)液。

1.2 試驗方法

1.2.1 南方根結(jié)線蟲的繁殖和二齡幼蟲的獲得 采用盆栽感病番茄繁殖南方根結(jié)線蟲。2019 年7月，將番茄種子催芽后播于采集的病土土樣中，繁殖南方根結(jié)線蟲。35 d 后，將植株根系取出并用流水沖洗表面泥土，用鑷子挑取根部線蟲卵塊于2 mL 離心管中，用1%次氯酸鈉振蕩3 min，7 000 r·min-1離心1 min，收集沉淀，用無菌水沖洗3 次。將消毒后的卵囊置于室溫條件下孵化10 d，每隔24 h收集二齡幼蟲，用無菌水將其配制成200 條·mL-1的線蟲懸浮液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ZZ-9 菌株活菌液的制備 將純化保存的ZZ-9 菌株接種于高氏1號培養(yǎng)基，于28 ℃、相對濕度50%的條件下黑暗培養(yǎng)7 d。向150 mL 三角瓶中加入60 mL 高氏1號液體培養(yǎng)基，將ZZ-9 菌株菌餅（直徑5 mm）挑取到三角瓶中，每個三角瓶接6 個菌餅，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，制成種子液；按照10%的接種量將種子液接入到80 mL 的小米浸汁培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d 后，即為活菌液。

1.2.3 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液的制備 將活菌液在4℃、10 000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液，用0.22 μm 微孔濾器過濾，即為無菌發(fā)酵濾液原液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 噻唑膦溶液的制備 將有效成分含量為20%的噻唑膦用無菌水配制成有效成分含量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1的噻唑膦溶液備用。

1.2.5 ZZ-9 菌株活菌液、發(fā)酵濾液殺線活性測定 將ZZ-9 菌株活菌液和發(fā)酵濾液原液分別稀釋5、10、15、20 倍，將活菌液和發(fā)酵濾液的0（原液）、5、10、15、20 倍液分別加入無菌24 孔細胞培養(yǎng)板（直徑20.0 mm）中，每孔加入300 μL，再加入10 μL 線蟲懸浮液（200 條·mL-1），以加入300 μL無菌水和10 μL 線蟲懸浮液為對照，每個處理3 次重復，每重復3板。密封后在25 ℃條件下保濕培養(yǎng)，分別于24 h 和48 h 觀察并記錄線蟲的死亡情況，計算死亡率和校正死亡率。

死亡率（%）=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)× 100

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對照死亡率）/（100 -對照死亡率）× 100

1.2.6 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與噻唑膦復配殺線活性測定 將ZZ-9 菌株發(fā)酵原液和5 個濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg·mL-1）的噻唑膦溶液分別以1V∶1V、2V∶1V、3V∶1V復配，利用渦旋振蕩儀使其混合均勻。按照1.2.5 方法測定48 h 后的殺線活性。

1.3 線蟲死亡情況的判斷

采用體態(tài)法、挑針刺激法和NaOH 刺激法判斷線蟲死亡情況。在光學顯微鏡下，觀察不同處理的南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲存活情況。死亡的二齡幼蟲蟲體一般為僵直狀態(tài)，存活的二齡幼蟲蟲體一般為彎曲狀，且不斷地游動；用挑針輕輕撥動蟲體僵直的二齡幼蟲，靜止不動的即為死亡個體。最后一次觀察時，向細胞培養(yǎng)板孔中滴入1%的NaOH溶液，在顯微鏡下觀察，靜止不動的即為死亡個體。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件和DPS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZZ-9 菌株活菌液的殺線活性

ZZ-9 菌株活菌液原液及其不同濃度稀釋液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲均有毒殺作用，其中活菌液原液對二齡幼蟲的毒殺效果最好，處理48 h 時死亡率、校正死亡率分別達38.89%、36.13%（表1）。相比原液，各濃度稀釋液對二齡幼蟲的毒殺作用顯著下降，這可能是由于稀釋后活菌液中的活菌濃度不足所導致。

表1 ZZ-9 菌株活菌液及不同濃度稀釋液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用

2.2 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液的殺線活性

ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液及其不同濃度稀釋液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲均有毒殺作用，其中發(fā)酵濾液原液對二齡幼蟲的毒殺效果最好，處理48 h 時死亡率、校正死亡率分別為23.48%、11.87%；隨著發(fā)酵濾液濃度的降低，校正死亡率明顯下降（表2）。

表2 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液及不同濃度稀釋液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用

2.3 噻唑膦溶液的殺線活性

隨著噻唑膦濃度的增加和處理時間的增長，南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的死亡率逐漸上升，1.0 μg·mL-1噻唑膦處理48 h 的校正死亡率達到78.88%（表3）。

表3 不同濃度噻唑膦溶液對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用

2.4 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與噻唑膦溶液不同比例復配的殺線活性

從表4 可以看出，處理48 h 后ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液原液與噻唑膦溶液1V∶1V復配對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用顯著，且噻唑膦溶液濃度越大對二齡幼蟲的毒殺效果越好，1.0 μg·mL-1噻唑膦與等體積ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液復配處理48 h 后校正死亡率為72.64%；3V∶1V復配對二齡幼蟲的毒殺作用最弱，且對噻唑膦濃度不敏感。

表4 ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液與噻唑膦溶液不同比例復配對南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺作用

3 結(jié)論與討論

放線菌能夠通過代謝產(chǎn)生抗生素，誘導植物提高抗性來抑制病原菌的侵染，在生物防治中具有較強的應用前景。研究表明，婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病有較好的拮抗作用，能夠抑制病原菌在土壤中的繁殖與侵染（劉琴 等，2020）。小鏈霉菌H-2 菌株對南方根結(jié)線蟲具有較高的殺線蟲活性，且對南方根結(jié)線蟲卵囊孵化具有較好的抑制作用（陳井生 等，2015）。本試驗結(jié)果表明，婁徹氏鏈霉菌ZZ-9 菌株活的菌液和發(fā)酵濾液均對南方根結(jié)線蟲有毒殺作用，這與Mookkan 等（2019）的研究結(jié)果相似，婁徹氏鏈霉菌能夠產(chǎn)生吡咯烷-2，4-二酮（Pyrrolidine-2，4-Dione），這種活性物質(zhì)對模式生物豐年蝦（Artemia salinaL.）無節(jié)幼體具有較強的毒性（LC50=106.75 μg·mL-1）。推測這種活性物質(zhì)對南方根結(jié)線蟲也具有一定的毒殺作用，但對于南方根結(jié)線蟲的毒力強弱還需要對發(fā)酵濾液蒸餾萃取之后進行驗證。

目前，噻唑膦作為市面上防治根結(jié)線蟲的主要產(chǎn)品，對根結(jié)線蟲的防治效果較為理想（表3）。其作為主要的有機磷類殺線蟲劑，通過抑制線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性阻礙線蟲的神經(jīng)傳導而毒殺線蟲。但是，由于長期大量使用噻唑膦，線蟲出現(xiàn)了不同程度的抗藥性（楊波 等，2016）。研究表明，該殺線劑只是起到麻痹線蟲的作用，蟲體仍有復蘇的可能，進而會誘導線蟲產(chǎn)生抗藥性（張博，2002）。同時，由于化學農(nóng)藥的大量使用對生態(tài)平衡、食品安全等造成了嚴重影響，國家提出了化學農(nóng)藥減施增效戰(zhàn)略（徐長春，2018）。因此，對根結(jié)線蟲開展生物防治研究迫在眉睫。本試驗結(jié)果表明，ZZ-9 菌株發(fā)酵濾液原液和1.0 μg·mL-1噻唑膦等體積復配（每300 μL 復配溶液中噻唑膦原藥的含量為150 ng，即復配溶液中噻唑膦濃度為0.5 μg·mL-1），處理48 h 后南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率為72.64%，與單一使用0.6 μg·mL-1噻唑膦（校正死亡率為56.84%）相比，復配溶液的殺線效果上升了15.80 百分點，接近單一使用1.0 μg·mL-1噻唑膦溶液的殺線效果（校正死亡率78.88%）。通過生防菌與化學藥劑復配，減少了化學藥劑使用量，為在根結(jié)線蟲的防治過程中減施增效和延緩抗藥性提供了新的途徑。

盡管本試驗在室內(nèi)可控條件下顯示出了良好的殺線效果，但是生物制劑在實際應用中受到環(huán)境、土壤等多種因素的限制（金娜 等，2015），因此，對該混配劑的田間防治效果還需進一步研究。