花秀鳳 陳曦 黃銘奇 陳銑 朱朝輝 陳庚

（福州市蔬菜科學(xué)研究所，福建福州 350111）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）自20 世紀(jì)80年代在福建省福州和寧德地區(qū)開(kāi)始規(guī)模種植，各城鎮(zhèn)郊區(qū)出現(xiàn)了許多以草莓采摘為主的休閑觀光農(nóng)業(yè)，優(yōu)化了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了農(nóng)民增收。然而隨著草莓種植年限的增加，多數(shù)草莓種植園沒(méi)有進(jìn)行輪作或輪作不徹底，導(dǎo)致草莓生長(zhǎng)不良，病害嚴(yán)重，其中為害最重的是草莓根腐病，主要病癥：初期1～2 片葉片邊緣呈紫紅色，逐漸擴(kuò)展，直至所有葉片轉(zhuǎn)為紫紅色，植株根莖褐化，整株枯死。草莓根腐病在草莓定植后即開(kāi)始發(fā)生，開(kāi)花結(jié)果期進(jìn)入高發(fā)期，尤其是重茬多年的地塊，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)草莓園幾乎毀滅，給種植戶(hù)造成重大損失，該病已成為福建省草莓生產(chǎn)最主要的限制因素。

草莓根腐病是由多種病原菌引起的一類(lèi)病害的總稱(chēng)，引起草莓根腐病的病原超過(guò)20 種（趙秀娟等，2006），該病在全世界草莓種植區(qū)均有發(fā)生，如西班牙（Medina et al.，2012）、意大利（Manici et al.，2015）、澳大利亞（Golzar et al.，2007）、日本（Minegishi，1989）、美 國(guó)（Paulus，1990）、墨西哥（Narro et al.，2006）等國(guó)家。前人主要對(duì)當(dāng)?shù)匕l(fā)生的草莓根腐病進(jìn)行病原鑒定、病原菌的生物學(xué)特性以及防治藥劑的篩選等方面進(jìn)行研究，為草莓根腐病的綜合防治提供依據(jù)。國(guó)內(nèi)北京（盛茹媛等，2012；張陽(yáng) 等，2015；咸俊男 等，2017；孫倩 等，2019）、河南（朱曉琴 等，2017）、天津（姚玉榮 等，2019）、吉林（王中武和臧慧明，2011）、河北（徐淑華 等，2004；李向彬 等，2008）、山東（胡彥江和張如琴，2012；張悅麗 等，2015；趙宇等，2016）、甘肅（曹奎榮，2006）、安徽（寧志怨等，2017）、湖北（韓永超 等，2014）、黑龍江（盛茹媛，2012）等地區(qū)，對(duì)當(dāng)?shù)匕l(fā)生的草莓根腐病進(jìn)行了病原鑒定，明確了引起當(dāng)?shù)馗〉膬?yōu)勢(shì)菌，為當(dāng)?shù)夭葺〉姆乐翁峁┝酥笇?dǎo)。福建省草莓生產(chǎn)上發(fā)生的根腐病主要表現(xiàn)為葉片紫紅色，植株根莖褐化，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)福建省草莓根腐病病原菌進(jìn)行鑒定，以指導(dǎo)該病害的防控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2019 年11月至2020 年5月（草莓結(jié)果期）在福州市連江縣及閩侯縣、寧德市蕉城區(qū)和霞浦縣、福清市、長(zhǎng)樂(lè)市等地的草莓園采集草莓根腐病病樣20 份。

1.2 病原菌的分離和純化

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），高溫高壓滅菌后添加100 mg·L-1青霉素，防止雜菌污染。在草莓病株根莖部的病健交界處切取0.5 cm的小塊，用清水沖洗干凈，75%酒精浸泡消毒30 s左右，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，然后用無(wú)菌水漂洗3 次，用滅菌濾紙吸干，接種在PDA固體培養(yǎng)基上；25 ℃條件下暗培養(yǎng)5～7 d，挑取真菌菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)5 次，待菌種純化后觀察拍照。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

取純化后的菌株至馬鈴薯葡萄糖水（PD 液體培養(yǎng)基）中25 ℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌絲大量長(zhǎng)出后進(jìn)行離心，收集沉淀，采用生工生物工程（上海）股份有限公司提供的真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取真菌菌絲的總DNA，并用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積25 μL，其中10× PCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，30 ng 模板DNA，0.5 UTaqDNA聚合酶，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4℃終止反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照，并由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序菌株rDNA-ITS 序列由NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)。選取與病原菌ITS序列同源性高的菌株序列，利用MEGA 4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 致病性測(cè)定

采用室內(nèi)盆栽脫毒組培苗進(jìn)行傷根接種，使用紅寶草莓脫毒試管苗，移植到滅菌后的栽培基質(zhì)中，每盆1 株，置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)2 個(gè)月左右，長(zhǎng)成大苗后進(jìn)行傷根接種。將分離獲得的病原菌配制成濃度為1×106～1×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液。選取健康草莓植株，在根莖部切割面積0.5 cm2左右的小傷口，從小傷口處灌入25 mL 孢子懸浮液，以無(wú)菌水作為對(duì)照，3 次重復(fù)，每重復(fù)3 株，正常栽培管理。接種后觀察植株的發(fā)病情況，比較發(fā)病癥狀是否與原先田間采樣的病株癥狀相同或相似，并從發(fā)病的植株上重新分離病原菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根腐病主要特征

多年來(lái)在草莓結(jié)果期到福建省各地的草莓種植園進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)草莓根腐病發(fā)生普遍，近80%草莓園均有不同程度的發(fā)生，紅顏和隋珠等品種的發(fā)病率較低，甜查理和紅寶等品種發(fā)生嚴(yán)重，輕者死株率10%左右，重者全園毀滅。草莓根腐病在草莓定植后即開(kāi)始發(fā)生，開(kāi)花結(jié)果期進(jìn)入高發(fā)期。植株通常從外層老葉開(kāi)始發(fā)病，沿葉緣發(fā)生紫紅色不規(guī)則病斑，逐漸擴(kuò)展至整個(gè)葉片，進(jìn)而由外層老葉擴(kuò)展至心葉，直至所有葉片轉(zhuǎn)為紫紅色，根莖部褐化至植株死亡（圖1）。

2.2 病原菌的分離和純化

對(duì)20 份病樣進(jìn)行分離純化，篩選獲得5 個(gè)菌株，編號(hào)1～5，5 個(gè)菌株在PDA 培養(yǎng)基上的菌絲體均呈白色絮狀，菌落背面黃色或淡黃色（圖2）。分生孢子堆呈散生黑色顆粒狀；分生孢子紡錘形，長(zhǎng)20～27 μm，有5 個(gè)細(xì)胞，中間3 個(gè)細(xì)胞為黃褐色或紅褐色，顏色深；基部和頂部細(xì)胞為錐形，顏色淡，呈透明狀，頂生毛2～3 根，尾毛1 根（圖3）。根據(jù)菌株形態(tài)特征，初步將分離獲得的5 個(gè)菌株鑒定為擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsissp.）。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

將5 個(gè)菌株提取的DNA 通過(guò)引物ITS1 和ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均能擴(kuò)增出清晰且單一的條帶，且大小相似，在500 bp 左右（圖4）。5 個(gè)菌株所測(cè)的ITS 序列相同，為5′-GGGGGATTAGAGTTTC TAACTCCCACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTG CCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTG CTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTAT GTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCG ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTG GGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTA AGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTTTT ATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGAT TTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTTC TCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGC TAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATC AGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA ATAAGCGGAGGAA-3′。所得序列（記為GZ）在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，該序列與Pestalotiopsis clavispora（登錄號(hào)FJ517545.1）菌株的同源性最高，為99.81%。與8 個(gè)同源性高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，該序列（GZ）與Pestalotiopsis clavispora（登錄號(hào)FJ517545.1）聚為一個(gè)分支（圖5）。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，將其鑒定為棒形擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）。

2.4 致病性測(cè)定

健康草莓植株接種病原菌3 周后，葉片出現(xiàn)紫紅色，而后逐漸擴(kuò)展，表現(xiàn)出與田間病株相同的發(fā)病癥狀，病株失去活力，植株僵化停止生長(zhǎng)，莖基部切面變褐，而對(duì)照葉片顏色正常，無(wú)發(fā)病癥狀（圖6）。對(duì)發(fā)病的草莓植株莖基部的病原菌進(jìn)行重新分離、鑒定，得到相同的病原菌。

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的植物病原菌分類(lèi)鑒定主要依據(jù)其形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，但由于形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件和其他因素的影響，給分類(lèi)鑒定工作帶來(lái)困難，分類(lèi)準(zhǔn)確性也無(wú)從保證。而病原菌DNA 的堿基組成和遺傳穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，且在生活史任何階段均可獲得（陳劍山和鄭服叢，2007）。ITS 區(qū)在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常近的兩個(gè)種在ITS 序列上也能表現(xiàn)出差異（鄭雪松 等，2003）。因此，應(yīng)用rDNA的ITS 序列能夠更準(zhǔn)確地鑒定出病原菌種類(lèi)。本試驗(yàn)對(duì)20 個(gè)草莓根腐病病樣進(jìn)行分離純化，獲得5 個(gè)菌株，通過(guò)菌株的形態(tài)特征、基因組ITS 序列分析及致病性接種試驗(yàn)，鑒定出福建省草莓根腐病病原菌為棒形擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的草莓根腐病病原菌以尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum loeosporioides）（王中武和臧慧明，2011；胡彥江和張茹琴，2012；盛茹媛 等，2012；韓永超 等，2014；張陽(yáng) 等，2015；張悅麗 等，2015；趙宇等，2016；寧志怨 等，2017；咸俊男 等，2017）較多，此外終極腐霉（Pythium ultimum）（張悅麗等，2015）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）（張陽(yáng)等，2015）、惡疫霉（Phytophthora cactorum）（孫倩 等，2019）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）（朱曉琴 等，2017）等病原菌也可引起草莓根腐病。徐淑華等（2004）研究認(rèn)為，引起河北滿(mǎn)城地區(qū)草莓根腐病的致病菌主要是擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）；趙宇等（2016）研究認(rèn)為，引起山東省青島市草莓根腐病的病原菌有棒形擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis clavispora）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）；Chamorro 等（2015）研究認(rèn)為，Pestalotiopsis clavispora能夠引起西班牙地區(qū)草莓冠和根的變色或壞死。

擬盤(pán)多毛孢是一類(lèi)常見(jiàn)的真菌，寄主范圍廣，能侵染100 多種植物，可引起枇杷葉斑?。钚憔甑龋?003）、蘋(píng)果輪紋斑病（易建平 等，2006）、藍(lán)莓根腐?。ㄑΦ聞?等，2018）等多種植物病害，導(dǎo)致重要經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量損失嚴(yán)重（韋繼光 等，2006）。在該病原菌的生物學(xué)特性和有效化學(xué)藥劑篩選研究方面，楊秀娟等（2003）研究認(rèn)為，枇杷擬盤(pán)多毛孢菌適宜生長(zhǎng)溫度范圍較窄，最適生長(zhǎng)溫度為20～25 ℃，30 ℃以上菌絲生長(zhǎng)受阻，15 ℃菌絲仍可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)緩慢，屬中低溫型病原菌，病原菌菌絲體對(duì)尿素和硫酸銨較為敏感，使用咪鮮胺錳鹽（施保功）、多菌靈、代森錳鋅等藥劑復(fù)配均能有效抑制該病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。薛德勝等（2018）測(cè)試了8 種藥劑對(duì)藍(lán)莓?dāng)M盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsissp.）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示8 種化學(xué)藥劑對(duì)病原菌均有不同程度的抑制作用，且隨藥劑濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng)。由棒形擬盤(pán)多毛孢引起的草莓根腐病其防治藥劑的篩選尚未見(jiàn)報(bào)道。一直以來(lái)農(nóng)戶(hù)主要用惡霉靈來(lái)防治草莓根腐病，惡霉靈對(duì)鐮刀菌（Fusariumsp.）、絲核菌（Rhizoctoniasp.）、腐霉菌（Pythiumsp.）、疫霉菌（Phytophthorasp.）引起的草莓根腐病防效較好，而對(duì)由棒形擬盤(pán)多毛孢引起的草莓根腐病防治效果不理想。本試驗(yàn)分離鑒定出了福建省草莓根腐病的病原菌，為下一步篩選對(duì)癥的防治藥劑奠定基礎(chǔ)。