管俊嬌 楊龍 木萬福 楊曉洪 張鵬 黃清梅 張建華

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南昆明 650205；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南元謀 651399；3 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，云南昆明 650205）

青花菜（Brassica oleraceaL.var.italicaPlenck）又名綠色花椰菜、西蘭花、綠菜花等，是起源于歐洲地中海沿岸的甘藍(lán)類蔬菜變種。因其具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和防癌抗癌功效，近年來成為深受人們喜歡的健康食品，需求量和種植面積逐年增加。中國已成為青花菜重要的生產(chǎn)國，種植面積接近全球的30%，但生產(chǎn)用種主要依賴進(jìn)口。雖然國內(nèi)育種家們經(jīng)過多年努力選育出了一些優(yōu)良青花菜新品種，但是目前生產(chǎn)中青花菜用種90%以上仍然為進(jìn)口，種子價(jià)格昂貴。隨著對品種和種子需求的急劇增加，種子市場中的“多、亂、雜”現(xiàn)象，“同種異名”“同名異種”“假冒套牌”等現(xiàn)象頻發(fā)，對青花菜產(chǎn)業(yè)的良性健康循環(huán)發(fā)展極為不利。加之農(nóng)作物品種管理和種子質(zhì)量管理技術(shù)滯后，造成了種子生產(chǎn)、質(zhì)量和市場管理混亂，使國家和農(nóng)民利益受到重大損害，也重挫了育種家的創(chuàng)新力。亟需建立一套快速、準(zhǔn)確可靠、操作簡便的品種鑒定識(shí)別技術(shù)，為青花菜品種管理提供技術(shù)支撐，為非主要農(nóng)作物商品種子進(jìn)口監(jiān)管提供技術(shù)支持。

DNA 指紋圖譜不受環(huán)境條件的影響，可以從分子水平上對品種的遺傳特異性進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定，被認(rèn)為是品種鑒定最簡單、有效的方法（高源 等，2015）。而分子身份證則是在得到DNA 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，運(yùn)用不同的編碼方式對指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理后得到字符串，能夠更加簡單明了地區(qū)分種質(zhì)資源，計(jì)算機(jī)自動(dòng)比對種質(zhì)資源差異，克服人工比對的繁瑣、低效等問題（陳昌文等，2011；徐雷鋒 等，2014）。在眾多的分子檢測技術(shù)中，SSR 標(biāo)記因具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性遺傳和易于檢測等優(yōu)點(diǎn)（王鳳格 等，2014），被植物品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）推薦為農(nóng)作物品種鑒定和構(gòu)建指紋數(shù)據(jù)庫的方法之一（滕海濤 等，2009）。目前已開展了水稻（陸徐忠 等，2014）、玉米（王鳳格 等，2017）、大豆（李清 等，2020）、蘋果（高源 等，2015；李慧峰 等，2020）、甘藍(lán)型油菜（馬琳 等，2013）、梨（張靖國 等，2014）、蘿卜（邱楊 等，2014）等作物分子身份證的研究工作，這些研究對農(nóng)作物品種資源評價(jià)、利用和保護(hù)等起到了重要作用。

本試驗(yàn)以青花菜22 個(gè)主要栽培品種為試材，篩選最佳引物組合，采用熒光SSR 分子標(biāo)記技術(shù)建立品種指紋圖譜，構(gòu)建各栽培品種獨(dú)有的、可辨的條形碼鑒定標(biāo)識(shí)即分子身份證，以期用最簡引物組合實(shí)現(xiàn)品種的最大程度區(qū)分，減少繁復(fù)的工作量和高昂的檢測成本，為青花菜品種的快速識(shí)別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取在國內(nèi)分布面積較大的青花菜栽培品種22 個(gè)，均為一代雜種，其中國內(nèi)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)品種3 個(gè)，進(jìn)口品種19 個(gè)（表1）。2020 年8月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所基地種植，苗期取幼嫩葉片，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取 每品種混合取20 個(gè)單株的葉片，采用改良的CTAB 法（Porebski et al.，1997）提取DNA。

1.2.2 SSR 引物篩選 依據(jù)前人研究公布的甘藍(lán)類SSR 遺傳標(biāo)記（Li et al.，2013；王慶彪 等，2014；張志仙 等，2017；劉春晴 等，2018；Zhu et al.，2018；林暉 等，2019；盛小光 等，2019；褚云霞等，2020），經(jīng)過初篩，在每條染色體上均勻選擇1～3 對，共22 對SSR 熒光標(biāo)記引物（表2）用于遺傳多樣性檢測。PCR 反應(yīng)體系（10 μL）包括：2× mix 混合液5 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，樣品DNA 1 μL，超純水3.4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。引物及試劑均由上海摯科生物有限公司提供。擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)AB 3730XL DNA 分析儀（Applied Biosystems，USA）上檢測。利用GeneMapper Ver.3.7 軟件（Applied Biosystems，USA）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和校正，讀出每個(gè)樣品各位點(diǎn)的等位變異擴(kuò)增片段大小數(shù)據(jù)。

表2 22 對SSR 引物信息

1.2.3 品種身份證的構(gòu)建 采用PowerMarker V3.25 軟件計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）和基因多樣性（gene diversity，D），以及Nei’s 遺傳距離并按非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。對引物進(jìn)行二次篩選，篩選出鑒別青花菜品種的核心引物，讀取22 個(gè)青花菜品種的核心SSR熒光標(biāo)記的指紋數(shù)據(jù)，并對指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字化編碼。編碼中擴(kuò)增信息標(biāo)注方式依據(jù)擴(kuò)增位點(diǎn)分子量從小到大的順序記錄各檢測位點(diǎn)的分子量（略去單位bp，只記錄數(shù)字），如果1 個(gè)品種經(jīng)同一引物擴(kuò)增同時(shí)檢測出多個(gè)位點(diǎn)，則用“-”連接數(shù)字，即可簡單表示每個(gè)品種的擴(kuò)增信息。再結(jié)合品種的基本信息，利用二維碼生成軟件將編碼字符串轉(zhuǎn)化成每個(gè)品種獨(dú)特的條碼標(biāo)識(shí)，即分子身份證。

評估引物多態(tài)性高低的指標(biāo)采用多態(tài)性信息含量（PIC）和基因多樣性（D）。

式中，Pi和Pj分別代表第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率，且i≠j。

式中，Plu代表第l個(gè)基因位點(diǎn)第u個(gè)等位基因的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

22 對SSR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳檢測后，每對引物在每份樣品中均可獲得精確的DNA 片段。22 對引物在22 份樣品中共擴(kuò)增出60 個(gè)等位基因，平均每對引物擴(kuò)增出2.7 個(gè)，60 個(gè)等位基因共組成了73 個(gè)基因型。其中，引物BoGMS1004、BoE718、BoGMS0941 擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目最多（5.0 個(gè)）；而引物BoE450、HCSSR1、Na10D03 只擴(kuò)增出1 個(gè)條帶，不具備多態(tài)性。基因多樣性的變異范圍為0～0.7，平均為0.4；多態(tài)性信息含量（PIC）的變異范圍為0～0.7，平均為0.4，其中在BoGMS0941、BoE723、BoE718、BoGMS1119 等位點(diǎn)所檢測到的PIC 值較大（表3）。

表3 22 對SSR 引物在青花菜中檢測到的遺傳多樣性信息

2.2 最佳引物組合篩選

分子身份證的構(gòu)建既要滿足唯一性和可識(shí)別（鑒別）性，又要同時(shí)滿足最簡引物組合的要求，否則將會(huì)造成構(gòu)建的分子身份證冗繁?；蛐蛿?shù)、多態(tài)性信息含量高的引物鑒別力較強(qiáng)。根據(jù)這些原則對22 對引物進(jìn)行篩選優(yōu)化，刪除鑒定性差的等位基因位點(diǎn)，選擇基因型數(shù)、多態(tài)性信息含量高的引物。

使用1 對SSR 引物難以將22 個(gè)青花菜品種全部區(qū)分開，選取多態(tài)性較高的引物BoGMS0941、BoE718、BoE723、BoGMS1119、BoGMS1004、BoGMS0501 兩兩組合，分析其對參試品種的區(qū)分率。BoGMS0941 和BoE718 引物組合分辨率最高，可以區(qū)分11 個(gè)品種；其次是BoE718 和BoGMS1004 引物組合，可以區(qū)分10 個(gè)品種；再次是BoGMS0501 和BoGMS1119 引物組合，可以區(qū)分9 個(gè)品種。根據(jù)2 對引物組合的區(qū)分結(jié)果，繼續(xù)增加引物組合的數(shù)量。在增加到4 對引物時(shí)，可以將全部青花菜品種區(qū)分開來，這4 對引物為BoGMS0941、BoE723、BoE718、BoGMS0501。

2.3 聚類分析

根據(jù)22 個(gè)青花菜品種的Nei’s 遺傳距離（表4），利用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。通過遺傳距離進(jìn)行聚類可以將22 個(gè)品種全部區(qū)分開來，其中耐寒優(yōu)秀與MKS-1307 遺傳距離最大，達(dá)到了1.00；其次是雅翠91 與云青花18115、女神、喜鵲、貝綠美，強(qiáng)漢與貝綠美、蝴蝶，遺傳距離為0.88；而翡翠11號(hào)與雅翠91，云青花18115 與綠輝7號(hào)，17-2305 與錦翠2號(hào)，錦翠2號(hào)與美青的Nei’s 遺傳距離最小，為0.07。聚類結(jié)果表明（圖1），22 個(gè)青花菜品種在遺傳距離為0.30 處被分為兩大分支，第一分支包括耐寒優(yōu)秀、美青、翡翠11號(hào)等9 個(gè)品種，第二分支包括冷翠、女神、三月鮮等13 個(gè)品種。

表4 22 個(gè)青花菜品種的Nei’s 遺傳距離矩陣

2.4 品種身份證編碼

利用篩選出的4 對核心引物構(gòu)建22 個(gè)青花菜品種的分子指紋圖譜，圖2 為美青在4 個(gè)SSR 位點(diǎn)的分子指紋圖譜。讀取22 個(gè)青花菜品種的4 個(gè)SSR 熒光標(biāo)記的指紋數(shù)據(jù)（表5），按標(biāo)記所在染色體由小到大排序，即按照BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723 的順序依次排列。例如，美青的擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)檢測得到的片段大小（bp）為249/249、175/224、209/222、179/179（青花菜為二倍體，SSR 擴(kuò)增只有1 條主帶時(shí)，須重復(fù)記錄1 次）。

表5 22 個(gè)青花菜品種的分子指紋信息

按順序排列4 對引物的擴(kuò)增片段大小作為品種的分子指紋信息，再加上青花菜品種的基本商品信息，包括作物種類、品種植物學(xué)類型、品種繁殖類型、品種名稱、生產(chǎn)經(jīng)營者名稱，最后利用二維碼技術(shù)將每個(gè)品種按相同順序排列的字符串轉(zhuǎn)化成其唯一的二維碼標(biāo)識(shí)，即分子身份證。美青的二維碼分子身份證如圖3-a 所示，掃碼后內(nèi)容如圖3-b所示。

3 結(jié)論與討論

3.1 青花菜品種鑒別引物篩選

SSR 分子標(biāo)記作為穩(wěn)定、高效且多態(tài)性好的品種鑒定方法，被廣泛應(yīng)用于作物的鑒評研究中。本試驗(yàn)利用篩選出的22 對SSR 引物對22 個(gè)青花菜品種的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，共檢測到60 個(gè)等位位點(diǎn)，平均每對引物擴(kuò)增出2.7 個(gè)等位位點(diǎn)，22對引物的多態(tài)性信息含量（PIC）在0～0.7 之間，平均為0.4。在前人的研究中，張志仙等（2017）利用14 對引物在28 份青花菜材料中共擴(kuò)增出94個(gè)條帶，平均每對引物擴(kuò)增出6.71 條，多態(tài)信息量為0.20～0.91，遺傳相似系數(shù)在0.585 1～0.904 3之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.728 9。儲(chǔ)云霞等（2020）采用36 對引物在110 個(gè)青花菜和63 個(gè)花椰菜品種中共擴(kuò)增出269 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對引物的多態(tài)性條帶數(shù)在2～17 個(gè)之間，平均7.47 個(gè)。相比較而言，由于本試驗(yàn)采用的青花菜品種為目前市場主推品種，育種過程降低了變種內(nèi)的遺傳多樣性水平，引物的多態(tài)性較低。構(gòu)建種質(zhì)的分子身份證，要求用最少的引物數(shù)量區(qū)分最多的種質(zhì)（高源 等，2015）。因此，依據(jù)引物對品種的區(qū)分率、引物擴(kuò)增等位基因數(shù)量和多態(tài)性信息含量，由高到低，從1 對引物開始，逐步增加引物組合的數(shù)量，直至獲得能夠鑒別全部品種的引物組合，達(dá)到使用最少的引物可以區(qū)分最多的品種的目的。本試驗(yàn)中，篩選出的4 對核心引物組合就可將參試的22 個(gè)青花菜品種進(jìn)行區(qū)分，隨著需要鑒別的品種數(shù)量增加，現(xiàn)有引物無法全部區(qū)分時(shí)，可增加其他引物進(jìn)行鑒定和構(gòu)建品種分子身份證。

3.2 分子身份證構(gòu)建分析

DNA 指紋圖譜是快速鑒別植物品種的有效工具。DNA 指紋圖譜構(gòu)建采用的方法有特征引物法、單引物法和核心引物組合法（蔣林峰 等，2014）。但特征引物法需要獲取不同品種的特異性等位基因，需要對現(xiàn)有的品種進(jìn)行大量的引物篩選，大大降低了鑒定效率。本試驗(yàn)采用4 對SSR 引物組合構(gòu)建了22 個(gè)青花菜品種的分子指紋圖譜，之后將分子指紋數(shù)據(jù)及相關(guān)品種信息導(dǎo)入二維碼生成器，成功構(gòu)建數(shù)字化的22 份青花菜分子身份證。將所得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化的信息，檢索該品種時(shí)更加方便且全面。本試驗(yàn)構(gòu)建的品種分子身份證二維碼可以通過制作標(biāo)簽，標(biāo)識(shí)于商品種子包裝上，直接用于優(yōu)良品種種子的防偽和溯源，使用者可用讀碼器獲得品種信息，對規(guī)范種子市場管理具有促進(jìn)作用。