范麗娜 高文征 李曉東 黃澤軍 國艷梅 舒金帥 劉磊李君明杜永臣王孝宣*

（1 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 陜西金鵬種業(yè)有限公司，陜西楊凌 712100）

番茄病毒病在全球普遍發(fā)生，其中番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒是兩種最具破壞性的病毒，給番茄生產造成嚴重損失。番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）隸 屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），是單鏈環(huán)狀的DNA 病毒（Liu et al.，1998）。該病毒通過介體煙粉虱傳毒，發(fā)病癥狀為：植株頂部葉片皺縮變小，中下部葉片黃化、變厚變硬、邊緣卷曲，葉脈呈紫色；發(fā)病后期植株矮縮嚴重，生長減緩或停滯，新葉變小，有皺褶，無法正常開花、坐果。番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）隸屬長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），由2 條正義單鏈RNA（+ss RNA）組成（Wintermantel et al.，2001）。該病毒亦由煙粉虱傳播，最初在我國臺灣報道發(fā)生，隨后在北京、江蘇、山東、河北、天津、河南、陜西等地發(fā)生（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；高利利 等，2015；吳淑華 等，2016；王志榮 等，2018）。發(fā)病癥狀為：從植株中下部開始出現(xiàn)葉片脈間褪綠黃化，葉脈仍保持綠色，葉片變厚變脆、易折斷；發(fā)病后期整株變黃，衰老死亡，果實無法正常彭大，產量受到嚴重影響。

由于TYLCV 和ToCV 的發(fā)病時間、所需環(huán)境條件和傳播媒介相似，故復合侵染發(fā)生比較普遍，近年來在山東（趙黎明 等，2014）、天津（高利利等，2015）、河北（孫國珍 等，2015）、江蘇（吳淑華 等，2016）、云南（劉薇 等，2018）、沈陽（趙秀香 等，2019）等省市均有報道。發(fā)生ToCV 和TYLCV 復合侵染的范圍和危害程度逐漸擴大，給我國番茄病毒病的防控增加了困難。

抗TYLCV 基因的發(fā)現(xiàn)和抗性基因的克隆使番茄黃化曲葉病毒病得到有效防控，但目前尚未有抗ToCV 番茄品種育成的報道。在生產實踐和番茄抗ToCV 育種過程中，發(fā)現(xiàn)含有抗TYLCV 基因的番茄材料在TYLCV 和ToCV 復合侵染時對ToCV具有一定的耐性，但不同的抗性基因以及抗性基因的不同組合對ToCV 的耐性不同。為研究不同抗TYLCV 基因對ToCV 的耐性程度，本試驗利用11份攜帶不同抗TYLCV 基因的番茄材料，于2019年秋季在陜西楊凌通過田間煙粉虱自然接種方法進行接種鑒定，以明確單個和多個抗TYLCV 基因對ToCV 的耐性，以期為ToCV 的防治和番茄抗病育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年秋季在陜西楊凌進行。供試11份番茄材料及其攜帶抗TYLCV 基因的情況詳見表1，其中Money Maker 來源于美國番茄遺傳資源中心，果實中等大小，5 穗果后摘心的株高200 cm 左右，該品種不含任何抗TYLCV 基因，感病后易觀察發(fā)病癥狀，且其基因組信息明確；其余10 份材料均由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，均為大果型番茄，單果質量200 g 左右，5 穗果后摘心的株高170 cm 左右。

表1 供試番茄材料攜帶抗TYLCY 基因的情況

2019 年8月20日分別將11 份番茄材料播種于無蟲、無病的溫室內，常規(guī)育苗。待幼苗長至五葉一心時移入栽有感染ToCV 和TYLCV 的Money Maker 植株的溫室內，以煙粉虱自由繁殖方式傳毒；通風口及進出口使用60 目防蟲網覆蓋，杜絕室外蚜蟲、薊馬和煙粉虱進入。每份材料定植30 株，3次重復，隨機區(qū)組排列。待目測Money Maker 植株出現(xiàn)感病癥狀后，使用70%吡蟲啉水分散粒劑（艾美樂，德國拜耳集團）2 500～5 000 倍液和25%噻蟲嗪水分散粒劑（阿克泰，先正達集團股份有限公司）2 000～3 000 倍液殺滅煙粉虱，每隔5～7 d 噴施1 次，連續(xù)噴施3～4 次。之后常規(guī)田間管理。11月10日，Money Maker 全部發(fā)病時，每份材料分別選擇20 株進行發(fā)病情況及農藝性狀調查。

克隆載體pMD18-T 購自TaKaRa 公司，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 菌株、氨芐青霉素（Amp）購自上海唯地生物技術有限公司；RNA提取試劑盒購自Aidlab 生物公司；反轉錄試劑盒5X All-In-One RT MasterMix 購自北京依聯(lián)軒有限科技公司；凝膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit 由北京全式金生物科技有限公司提供；CTAB、EDTA、TRIS、PVP、巰基乙醇購自美國Amresco 公司；DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Ladder 購自天根生化科技（北京）有限公司；2X GoTaq GreenMaster Mix 由北京聚合美生物科技有限公司提供；其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄葉片總DNA 和總RNA 的提取 在定植后和全部材料發(fā)病后，分別對感病植株上部、下部葉片進行混合取樣，采用CTAB 法（Harrison et al.，1997）提取總DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?；按照RNA 提取試劑盒的說明書提取總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r提取健康植株葉片的總DNA 和總RNA 作為陰性對照。

1.2.2 抗性基因PCR 檢測 利用TYLCV 特異性引物Ty-1、Ty-2 和Ty-3（表2）分別檢測11 份番茄材料攜帶的抗性基因。PCR 擴增體系（20 μL）：模板DNA 2 μL，2X GoTaq Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，X ℃（表2）30 s，72℃ 1 min，循環(huán)32 次；72 ℃ 10 min。PCR 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并拍照。

1.2.3 番茄植株發(fā)病情況調查 參照馬瑞麗（2019）的方法，對番茄褪綠病毒病進行調查、分級，計算病情指數。

分級標準：0 級，植株無癥狀；1 級，植株下部僅有部分葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；2 級，植株從下部開始有50%葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；3 級，植株大面積葉片出現(xiàn)葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；4 級，植株整株褪綠黃化嚴重，基本沒有健康組織。

病情指數（DI）=∑（各級病株數×相應級數）/（調查總株數×最高級數）× 100

1.2.4 TYLCV 和ToCV 的分子鑒定 取11 份番茄材料感病植株的DNA，利用TYLCV 的特異引物TYLCV1、TYLCV2、TYLCV3（表2，這3個引物經測序拼接后能得到2 781 bp 的整個DNA-A 基因）進行PCR 擴增，方法同1.2.1。

取11 份番茄材料感病植株的RNA，參照Applied Biological Materials 公司的5X All-In-One RT Master Mix 試劑盒說明書進行cDNA 合成。具體步驟：在冰上融化RNA 樣品和5X All-In-One RT Master Mix；取RNA 5 μL，5X All-In-One RT Master Mix 2 μL，Nuclease-H2O 3 μL，在冰上輕輕混勻；25 ℃ 10 min；42 ℃ 50 min；85 ℃ 5 min，立即放回冰上。將得到的cDNA 放入-20 ℃冰箱保存。ToCV 檢測采用cDNA 和ToCV 的特異引物ToCVqF/R（表2）進行PCR 擴增，方法同1.2.1。

表2 試驗所用引物序列及退火溫度

PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。將目的譜帶用凝膠回收試劑盒回收后克隆到pMD18-T，之后轉化到大腸桿菌DH5α上，選取陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 序列分析及進化樹構建 將得到的TYLCV和ToCV 基因序列在NCBI 中進行分析比對，選取NCBI 上已登錄的TYLCV 和ToCV 基因分離物，利用Mega 7.0 軟件進行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建（采用鄰接法neighbor-joining，NJ）。

1.2.6 番茄農藝性狀調查 參照李錫香和杜永臣（2006）的方法測定株高、單株坐果數及單果質量。

2 結果與分析

2.1 番茄材料TYLCV 抗性基因分子標記分析

為了驗證各材料所攜帶的抗性基因，利用抗TYLCV 基因檢測引物對11 份番茄材料進行PCR擴增。結果表明，Money Maker 和18g-318 不含抗病基因，為感病材料；19g-883、19g-874、19g-832 的抗病基因型為Ty-1/ty-1、Ty-3/ty-3、Ty-2/ty-2，中雜302、19g-736、19g-785 基因型為Ty-1/ty-1、Ty-3/ty-3、ty-2/ty-2，172-1591、19g-700、19g-623 基因型為ty-1/ty-1、ty-3/ty-3、Ty-2/Ty-2。

2.2 番茄感病植株的ToCV 和TYLCV 鑒定

對11 份番茄材料的感病植株進行ToCV和TYLCV檢測（圖1），利用ToCV的特異引物ToCVqF/R 擴增出230 bp 大小的目的譜帶，利用TYLCV 的特異引物TYLCV3 擴增出833 bp 大小的目的譜帶，表明感病植株受到ToCV 和TYLCV 的復合侵染。

2.3 番茄植株田間發(fā)病情況調查

由圖2 可見，含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料19g-832、19g-883、19g-874 對ToCV 的耐性較好，病情指數低于43.5；含有TY-1/ty-1、TY-3/ty-3抗性基因的中雜302、19g-736、19g-785 對ToCV 的耐性次之，病情指數 在46.25～48.75之間；只含有TY-2/ty-2抗性基因的172-1591、19g-700、19g-623 對ToCV 的耐性稍差，病情指數大于54；而不含抗性基因的Money Maker 和18g-318 病情指數高達100.00。

番茄株高、單株坐果數、單果質量的測定結果（表3），進一步驗證了同時含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料生長勢較好，坐果率較高，果實成熟受影響較輕；而只含有單個TY-2/ty-2抗性基因的材料株高和單株坐果數受到較大影響。

表3 11 份番茄材料的農藝性狀測定結果

2.4 系統(tǒng)進化樹的構建

將測序得到的ToCV 的CP基因序列命名為SXYL，與NCBI 上已登錄的ToCV 分離物進行序列同源性分析及進化樹構建。同源性分析結果表明，SXYL 與巴西分離物JQ952601.1 同源性最低，為98.6%；與國內地區(qū)分離物的同源性均達到99%以上。進一步構建系統(tǒng)進化樹（圖3），SXYL 與吉林長春分離物KU306111.1、韓國分離物KP114528.1、日本分離物AB513433.1 及分離地區(qū)較近的陜西楊凌分離物MF346383.1、山西晉中分離物KX853540.1 在同一分支上。

將測序得到的TYLCV 的DNA-A 全基因命名為TYLCV-SXYL，與NCBI 上已登錄的TYLCV基因序列進行同源性分析及進化樹構建。同源性分析結果表明，TYLCV-SXYL 與伊朗分離物AJ132711.1 同源性最低，為94%；與國內地區(qū)分離物的同源性達到98%以上。進一步構建系統(tǒng)進化樹（圖4），TYLCV-SXYL 與北京分離物GU983859.1、山東壽光分離物KJ546418.1、遼寧建平分離物KJ754190.1 在同一分支上，且與國內其他地區(qū)的分離物在同一大分支上。

3 討論與結論

病毒的復合侵染在田間栽培中經常發(fā)生，在多個國家報道中發(fā)現(xiàn)番茄發(fā)生ToCV 時常與其他病毒病共同發(fā)病，與ToCV 發(fā)生復合侵染的病毒有番茄嚴重皺紋病毒（Tomato severe rugose virus，ToSRV）（Macedo et al.，2014）、鳳果花葉病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）（Davino et al.，2008）、番茄灼燒病毒（Tomato torrado virus，ToTV）（Gómez et al.，2010）、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）（García-Cano et al.，2006）等。在上述報道中發(fā)現(xiàn)，復合感染病毒的番茄植株發(fā)病癥狀比僅由單一病毒感染的發(fā)病癥狀嚴重，但目前關于其發(fā)病機理方面還沒有深入的研究。本試驗中，感染ToCV 和TYLCV 后，番茄植株頂部葉片出現(xiàn)皺縮，邊緣卷曲，葉片變厚變硬，表現(xiàn)出明顯的TYLCV 癥狀；植株下部葉片出現(xiàn)脈間褪綠黃化，但葉脈保持綠色，葉片變厚易折斷，表現(xiàn)出明顯的ToCV 癥狀；植株發(fā)病癥狀比單一的病毒感染嚴重且植株生長、坐果受到嚴重影響。

目前尚未有關于抗ToCV 的番茄栽培品種育成的報道，但在育種過程中發(fā)現(xiàn)含有抗TYLCV基因的番茄材料ToCV 發(fā)病較輕。本試驗利用11份攜帶不同抗TYLCV 基因的番茄材料，探究不同Ty抗性基因對ToCV 的耐性，結果表明含有抗TYLCV基因的番茄材料均對ToCV有一定的耐性，尤其同時含有TY-1/ty-1、TY-2/ty-2、TY-3/ty-3抗性基因的番茄材料在受到TYLCV 和ToCV 共同侵染時，ToCV 病情指數較低，且植株的生長勢、坐果能力、果實成熟度等受影響程度較輕。同時對ToCV 的CP基因和TYLCV 的DNA-A 全基因進行克隆和序列分析，結果表明復合侵染時的ToCV的CP基因核苷酸序列與國內分離物同源性均達到99%以上；TYLCV 的DNA-A 基因核苷酸序列與國內分離物同源性均在98%以上。表明復合侵染時TYLCV 和ToCV 沒有產生新的病毒菌株。雖然目前關于ToCV 與TYLCV 復合侵染的機制還不是很清楚，但病毒的復合侵染已給蔬菜生產造成了巨大的經濟損失，針對ToCV 與TYLCV 共同侵染在農業(yè)生產中應引起足夠的重視。