林忠鑫，王志超，竹萬寬，杜阿朋，許宇星*

不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌群落結構和多樣性研究

林忠鑫，王志超，竹萬寬，杜阿朋，許宇星

(1. 嶺南師范學院，廣東 湛江 524048；2. 國家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

為了研究不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌群落結構和多樣性的變化，選取廣西七坡林場不同連栽代次桉樹人工林作為研究對象，在調查9項化學指標基礎上，應用高通量測序平臺、冗余分析對不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌多樣性進行研究。結果表明：多代連栽經(jīng)營模式對土壤化學性質及真菌群落產(chǎn)生顯著影響。連栽模式引起土壤養(yǎng)分含量、真菌多樣性及豐富度在第2代桉樹人工林顯著升高后，在第3代和第4代人工林土壤中顯著下降。同時，多代連栽導致真菌群落結構的顯著變化，第3、4代人工林土壤優(yōu)勢真菌擔子菌門相對豐度顯著下降，而子囊菌門相對豐度顯著升高。速效鉀和硝態(tài)氮作為土壤關鍵因子驅動土壤真菌群落結構的演變過程。

桉樹人工林；高通量測序；土壤真菌；群落結構；多樣性

桉樹()原產(chǎn)地為澳大利亞，我國廣東、廣西、四川、云南、福建等地均有種植。桉樹生長快、周期短，在一定程度上緩解了全球范圍內(nèi)的木材供需矛盾。由于桉樹萌芽更新能力強，成林時間短，造林成本低，留萌連栽成為了國有林場及林農(nóng)的主要營林措施。在華南地區(qū)，近60%的桉樹林地選擇連栽經(jīng)營模式，部分林場甚至連栽4 ～ 5代桉樹人工林仍未改變林地用途，導致人工林地面臨養(yǎng)分流失、甚至地力衰退的風險，由多代經(jīng)營模式所帶來的生產(chǎn)力及生態(tài)問題已引起社會及相關專家的廣泛關注。

微生物作為土壤養(yǎng)分循環(huán)和土壤質量改善的核心驅動力，在生態(tài)系統(tǒng)調控土壤生物地球化學過程中起著重要作用。土壤微生物群落結構對環(huán)境質量變化高度敏感，其多樣性及群落結構常被用于評估生態(tài)系統(tǒng)對環(huán)境擾動的響應。在人工林經(jīng)營中，林業(yè)實踐過程對人工林生態(tài)系統(tǒng)植被結構及土壤養(yǎng)分可利用性造成顯著影響，而這些擾動會被土壤微生物記錄下來。多代連栽模式被廣泛應用于速生人工林經(jīng)營中，然而針對多代連栽模式對土壤真菌群落結構變化的研究報道較少。本文通過高通量測序分析對廣西4個不同連栽代次桉樹人工林土壤化學性質及真菌群落進行對比研究，將傳統(tǒng)土壤評價指標與微生物群落結構及其多樣性相結合，以期更深入地探索連栽桉樹人工林土壤質量演變過程。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于廣西國有七坡林場(21°85' ～ 22°10' N，107°61' ～ 107°96' E)。屬南亞熱帶季風氣候，年平均溫度21.7 ℃，年平均降雨量為1 200 ～ 1 300 mm。試驗地選取林場內(nèi)海拔416 ～ 583 m、坡度15 ～ 21°的丘陵地帶。以具有相同起源、直線分布距離小于1 km 的4片5年生尾巨桉()人工林作為研究對象(包含4個代次)。人工林代次即1種經(jīng)營措施，5年為1個輪伐期，皆伐后萌芽更新形成新一代桉樹人工林，依次循環(huán)。所有桉樹人工林植苗造林前，均為20年生馬尾松()人工林。

1.2 樣品采集

2019年7月，在4片桉樹人工林中分別設置4個20 m × 20 m 標準樣地。沿各樣地對角線利用土鉆隨機采集18個0 ～ 10 cm表土樣本，去除腐殖質與根系并均勻混合形成土壤樣本，每代次桉樹人工林得到4個重復土壤樣本。從每個樣品中取10 g土壤(過篩2 mm)置于10 ml冷存管中，立即浸泡在液氮中，用于后續(xù)微生物分析。剩余土壤風干后用于土壤化學分析。

1.3 土壤化學性質分析

土壤pH值采用pH計進行測定(1：2.5土水比)；土壤有機質采用重鉻酸鉀-硫酸-比色法測定。全氮、全磷和全鉀分別采用凱氏定氮法、堿熔-鉬銻抗比色法以及堿熔-火焰光度法測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別采用2 mol·LKCL浸出-靛酚藍比色法和紫外分光光度法測定；有效磷和速效鉀分別采用硫酸-鹽酸雙酸法和火焰光度法測定。

1.4 土壤真菌DNA提取與測序

根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行微生物群落總 DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA 濃度和純度；真菌ITS 序列使用引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')-ITS2R(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')。梯度PCR采用PCR儀(T100 Thermal Cyeler)進行，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用QuantusFluorometer(Promega, USA)對回收產(chǎn)物進行檢測，定量。使用DNA快速建庫試劑盒(NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit)進行建庫后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。為了減少測序深度對后續(xù)群落組成分析的影響，將每個樣本的序列數(shù)量細化到最小樣本量。利用Usearch 7.0 (http://www.drive5.com/usearch/)將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)，通常對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。調用Mothur軟件(v1.30.2)計算各個樣本Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計方法

土壤化學性質的數(shù)據(jù)利用EXCEL和SPSS 26.0軟件進行ANOVA單因素方差分析(LSD)完成。利用R語言進行真菌群落結構和土壤化學性質的冗余分析(RDA)。利用SPSS 26.0軟件進行真菌群落多樣性和土壤化學性質的相關性分析。對土壤真菌群落結構進行基于Unweighted_unifrac距離的主坐標分析(PCoA)，并通過置換多元方差分析PERMANOVA (Permutational Multivariate Analysis of Variance) 確定群落結構的差異水平。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

不同連栽代次桉樹人工林之間土壤化學性質存在顯著差異(<0.05，圖1)。其中，第2代桉樹人工林的pH值最高并達到顯著水平，至3 ～ 4代后有所下降，說明連栽代次的增加可能改變了林地土壤的酸度。隨著連栽代次的增加，土壤有機質含量顯著下降，表現(xiàn)為第1代桉樹人工林>第2代桉樹人工林>第3代桉樹人工林>第4代桉樹人工林(圖1)。土壤全氮、全磷、全鉀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效鉀含量均表現(xiàn)為第1、2代人工林顯著高于第3、4代人工林土壤。該結論同王嘉琛等對桂北不同連栽代次桉樹人工林土壤養(yǎng)分研究的部分結果一致。

2.2 測序數(shù)據(jù)結果

對不同連栽代次桉樹人工林進行測序，經(jīng)篩選后獲得的各個樣品的可注釋序列總數(shù)Counts，按照97%的相似度進行OTUs劃分，結果見表1。根據(jù)測序數(shù)量Counts可知，每個樣品的測序數(shù)量均在3萬條左右，說明測序的質量高，測序可信度高。

圖1 不同連栽代次桉樹人工林土壤化學性質

注：柱形圖中不同小寫字母表示<0.05。

表1 不同連栽代次桉樹人工林土壤OTU測序結果

注：First：第1代，Second：第2代，Third：第3代，F(xiàn)ourth：第4代。

2.3 真菌OTU分析

將測序得出的有效序列按照97%的相似性聚類為操作分類單元(OTU)后，統(tǒng)計出不同連栽代次桉樹人工林共有654個OTU，數(shù)量由高到低依次為：第2代桉樹人工林493個、第3代桉樹人工林451個、第1代桉樹人工林406個、第4代桉樹人工林294個。使用韋恩圖將OTUs進行劃分及可視化。不同連栽代次桉樹人工林共有OTU數(shù)目為150個，特有OTU數(shù)目由高到低依次為：第2代桉樹人工林54個、第3代桉樹人工林40個、第1代桉樹人工林32個、第4代桉樹人工林25個(圖2)。

圖2 真菌OTU的韋恩圖

2.4 真菌群落PCoA分析

整體系統(tǒng)真菌群落組成在不同連栽代次桉樹人工林之間存在顯著差異(<0.05，圖3)。第1代桉樹人工林、第2代桉樹人工林、第3代桉樹人工林、第4代桉樹人工林之間距離較遠，差異性較大。根據(jù)不同連栽代次桉樹人工林土壤的OTU，構建了一個主坐標排序，說明不同連栽代次桉樹人工林土壤群落的系統(tǒng)發(fā)育差異。主坐標分析(PCoA)結果表明，PC1的貢獻率為58.82%，PC2的貢獻率為16.19%，兩者共解釋了75.01%的方差變化。從不同連栽代次桉樹人工林的真菌群落組成來看，不同連栽代次桉樹人工林組內(nèi)真菌組成較為相似，組間差異較大。

圖3 真菌OTU主坐標分析

2.5 真菌群落結構分析

為了研究不同連栽代次桉樹人工林土壤樣品中真菌物種組成的多樣性，進行OTU聚類分析，根據(jù)OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，共統(tǒng)計得到11門。與其森林土壤相似，擔子菌門()和子囊菌門()為土壤優(yōu)勢真菌菌門類，占據(jù)總真菌豐度的88.85% ～ 93.63%。此外，第3代和第4代桉樹人工林的擔子菌門相對豐度均顯著高于第1、2代人工林，占據(jù)63.98% ～ 76.08%；第1、2代桉樹人工林的子囊菌門相對豐度顯著高于第3、4代人工林，其值為36.25% ～ 54.54%。桉樹人工林土壤擔子菌門相對豐度的顯著增加，可能同擔子菌門通常與根系形成共生關系有關。相關研究證實，外生菌根真菌與營養(yǎng)受限植物的養(yǎng)分吸收密切相關，其相對豐度增加被認為與它們從腐真菌物種的活菌絲或死菌絲捕獲和轉移營養(yǎng)物質有關。因此，本研究推測第3代和第4代桉樹人工林的養(yǎng)分脅迫可能通過增加樹木對真菌共生體的依賴來補償。此外，球囊菌門、壺菌門、單毛壺菌門、梳霉門在不同連栽代次中含量極少(圖4，表2)。

2.6 真菌群落多樣性

多代連栽模式顯著影響了桉樹人工林土壤真菌多樣性及豐富度(<0.01，表3)。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可以衡量土壤真菌群落物種數(shù)量的多少，指數(shù)數(shù)值越大說明真菌物種數(shù)量越高。本研究中，第2代桉樹人工林的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于第1代人工林。然而，隨著連栽代次的增加，第3代和第4代桉樹人工林豐富度指數(shù)顯著下降。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)反映土壤真菌群落物種多樣性，Simpson指數(shù)越小，Shannon指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性越高，同時前者側重于均勻度對優(yōu)勢OTU更敏感，而后者側重于群落的豐富度以及對稀有的OTU更敏感。與群落豐富度一致，隨著連栽代次的增加，土壤真菌多樣性表現(xiàn)為在第2代顯著升高后，在第3、4代人工林土壤中顯著下降(<0.01，表3)。原因可能在于：由前茬松樹樹種轉變?yōu)殍駱淙斯ち?，伴隨著大量新鮮的高質量有機物質的累積，這為第1、2代桉樹人工林土壤真菌的定殖提供了良好的棲息條件。隨著連栽代次增加，土壤含水量及養(yǎng)分狀況顯著下降，且分解進入后期階段的低質量凋落物大量累積，這些因素均導致真菌群落多樣性受到顯著負面影響。本文結論與ZHU等研究結果存在差異，該研究表明連栽第2、3、4代人工林土壤間真菌多樣性并未產(chǎn)生顯著變化。這可能歸因于采樣地地理位置，氣候海拔及采樣時間的差異。

圖4 不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌群落結構

表2 不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌主要菌門

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示<0.05。

2.7 土壤真菌群落多樣性及結構與土壤化學性質的關系

對真菌群落多樣性與土壤化學性質進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，真菌群落豐富度指數(shù)Ace和Chao1同土壤pH值、全磷、全鉀、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀呈顯著正相關關系，真菌群落多樣性指數(shù)Shannon同所有化學性質(除pH值)呈顯著正相關關系，而Simpson指數(shù)與大多數(shù)化學性質呈負相關(表4)。

RDA結果顯示，土壤真菌群落結構受到土壤速效鉀和硝態(tài)氮的驅動，進一步Monte Calo Permutation檢驗證實了其顯著性(圖5)。RDA1解釋了98.15%的變化，RDA2解釋了1.72%的變化，兩者共解釋了99.87%的方差變化。速效鉀與RDA1負相關性最強，相關系數(shù)為?0.96，主要表現(xiàn)在與子囊菌門和毛霉菌門呈現(xiàn)正相關性，與擔子菌門呈現(xiàn)負相關性。pH值與RDA2正相關性最強，相關系數(shù)為0.82，主要表現(xiàn)在與隱真菌門、被孢霉門和球囊菌門呈現(xiàn)正相關性，與擔子菌門、子囊菌門和毛霉菌門呈現(xiàn)負相關性。根據(jù)不同連栽代次桉樹人工林的歐幾里得距離，不同連栽代次桉樹人工林的采樣點存在一定的差異性，第3代桉樹人工林和第4代桉樹人工林之間的距離較小，表明其真菌群落較為相似?？傮w而言，不同連栽代次桉樹人工林之間距離存在顯著差異，速效鉀對土壤真菌群落結構的影響最大。

表3 不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌群落多樣性分析

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示<0.01。

表4 真菌群落多樣性與土壤性質的相關性

注：**在0.01水平(雙側)上顯著相關；*在0.05水平(雙側)上顯著相關。

圖5 土壤真菌群落結構與土壤化學性質的RDA分析

注：擔子菌門，子囊菌門，毛霉菌門，被孢霉門，隱真菌門，球囊菌門，壺菌門，單毛壺菌門，，梳霉門，pH：pH 值，SOM：有機質，NO-N：硝態(tài)氮，NH-N：銨態(tài)氮，TN：全氮，TP：全磷，TK 全鉀，AP：有效磷，AK：速效鉀。

3 結論

通過在不同連栽代次桉樹人工林內(nèi)布置16塊標準地，結合9項化學指標，應用高通量測序平臺、冗余分析和相關性分析，對不同連栽代次桉樹人工林土壤真菌多樣性進行研究，得出主要結論如下：

(1)不同連栽代次桉樹人工林之間土壤化學性質存在顯著差異。其中第2代桉樹人工林的大多數(shù)化學指標的含量均顯著高于其他連栽代次桉樹人工林。而在不同連栽代次桉樹人工林土壤中pH值、全磷、全鉀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量均表現(xiàn)出第2代桉樹人工林顯著高于其他連栽代次桉樹人工林，且到第3代桉樹人工林、第4代桉樹人工林后顯著降低。有機質含量隨著連栽代次的增加而逐代減少。這些結果說明，隨著連栽代次的增加會導致大多數(shù)化學指標出現(xiàn)降低的趨勢。

(2)測序結果表明真菌OTU在不同連栽代次桉樹人工林之間存在差異。PCoA結果顯示整體系統(tǒng)真菌群落組成在不同連栽代次桉樹人工林之間存在顯著差異，不同連栽代次桉樹人工林組內(nèi)真菌組成較為相似，組間差異較大。高通量測序結果表明：擔子菌門和子囊菌門為桉樹人工林的優(yōu)勢真菌菌門類，隨著連栽代次的增加，擔子菌門的相對豐度是先減少后增加再減少，而子囊菌門的相對豐度是先增加后減少再增加。

(3)土壤真菌群落豐富度指數(shù)(Ace、Chao1)和多樣性指數(shù)(Simpson、Shannon)在不同連栽代次之間存在極顯著差異。土壤真菌群落豐富度和多樣性表現(xiàn)為在第2代顯著升高，后隨著連栽代次的增加顯著下降，且真菌各項多樣性指數(shù)與土壤化學性質之間存在密切相關性。冗余分析結果表明速效鉀和硝態(tài)氮是驅動土壤真菌群落結構變化的關鍵環(huán)境因子。

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Structure and Diversity of Soil Fungal Communities Under Successive Rotations of

LIN Zhongxin, WANG Zhichao, ZHU Wankuan, DU Apeng, XU Yuxing

(1.2.)

This study examined changes of soil fungal community structure and diversity inplantations over successive rotations in Qipo Forest Farm, Guangxi. The soil fungal communities and their diversity were analysed using a high-throughput sequencing platform and redundancy analysis to evaluate nine chemical indicators. The results showed that multiple successive rotations had significant effects on soil chemical properties and fungal communities. Successive rotations caused a significant increase in nutrient content, fungal diversity and richness in the soil of second rotationplantations, followed by a significant decrease in these soil parameters in the third and fourth rotations. At the same time, multiple successive rotations led to significant changes in fungal community structures, with the relative abundance of the dominant fungal phylumdecreasing significantly and the relative abundance of phylumincreasing significantly in the soils by the third and fourth rotation of. The development and changes in soil fungal community structure appeared to be driven by the key soil factors of available potassium and nitrate nitrogen.

plantation; high-throughput sequencing; soil fungi; community structure; diversity

10.13987/j.cnki.askj.2021.04.001

S718.5

A

廣東省自然科學基金面上項目(2020A1515011404)；雷州半島多功能人工林構建技術及綜合效益評價(2018KJCX014)；廣東林業(yè)生態(tài)監(jiān)測網(wǎng)絡平臺建設項目及廣東省湛江桉樹森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站運營項目

林忠鑫(2000— )，男，在讀本科，E-mail:1205003260@qq.com

許宇星(1987— )，男，助理研究員，主要從事桉樹可持續(xù)經(jīng)營研究，E-mail:cercxuyx@caf.ac.cn