楊錦 韓偉 張永萍 陳曉蘭 李哲 劉杰 吳靜瀾

中圖分類號(hào) R283.6;R979.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）24-2980-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.07

摘 要 目的：制備白屈菜紅堿納米粒（CHE-NPs），對(duì)其處方進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)其體外釋藥行為及對(duì)黑色素瘤的抑制作用。方法：以甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（mPEG-PLGA）為載體材料，采用納米沉淀法制備CHE-NPs，采用高效液相色譜法和透析袋法測(cè)定包封率、載藥量。以二者的總評(píng)歸一（OD）值為因變量，以CHE投藥量、mPEG-PLGA質(zhì)量濃度、泊洛沙姆188（F68）濃度為自變量，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化CHE-NPs處方。檢測(cè)最優(yōu)處方所制CHE-NPs的粒徑和Zeta電位，考察其體外釋藥特征，比較CHE原料藥和CHE-NPs對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞存活率的影響并計(jì)算二者的半數(shù)抑制濃度。結(jié)果：最優(yōu)處方為CHE投藥量2 mg、mPEG-PLGA質(zhì)量濃度13 mg/mL、F68濃度1.8%。以此所制CHE-NPs的平均包封率為（80.18±1.11）%，平均載藥量為（11.36±0.28）%，平均OD值為0.96±0.04[與OD預(yù)測(cè)值（0.90）的相對(duì)偏差為6.67%]，粒徑為（113.1±1.40）nm，Zeta電位為（-21.6±0.29）mV，多分散性指數(shù)為0.07±0.01（n=3）。CHE對(duì)照品、CHE-NPs在孵育8 h時(shí)的累積釋放率分別為90.87%、68.68%，后者的體外釋藥行為符合Weibull動(dòng)力學(xué)模型。CHE-NPs對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用顯著強(qiáng)于CHE原料藥，CHE-NPs和CHE原料藥的24 h半數(shù)抑制濃度分別為69.35、107.36 μg/mL。結(jié)論：所制CHE-NPs具有緩釋作用和較強(qiáng)的載藥能力，同時(shí)增強(qiáng)了CHE對(duì)黑色素瘤的體外抑制作用。

關(guān)鍵詞 白屈菜紅堿;黑色素瘤;抑瘤作用;甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物;納米粒;Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)

Preparation of Chelerythrine Nanoparticles and Evaluation of Anti-melanoma Activity in vitro

YANG Jin1，HAN Wei1，ZHANG Yongping1，CHEN Xiaolan1，LI Zhe2，3，LIU Jie1，WU Jinglan1（1. College of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China; 2. College of Basic Medicine， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China; 3. Innovation Research and Development Center of Veterinary Traditional Chinese Medicine Preparations， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare chelerythrine nanoparticles （CHE-NPs）， optimize their formulation， and evaluate its drug release behavior in vitro and its inhibitory effect on melanoma. METHODS： Using methoxy polyethylene glycol-poly（lactic-co- glycolic acid） （mPEG-PLGA） as carrier， CHE-NPs were prepared by the nano-precipitation method. HPLC method and dialysis bag method were used to determine entrapment efficiency and drug loading. The formulation of CHE-NPs was optimized by Box-Behnken response surface design using overall desirability （OD） of them as dependent variables， CHE dosage， mPEG-PLGA concentration and poloxamer 188 （F68） concentration as independent variables. The particle size and Zeta potential of CHE-NPs prepared by the optimal formulation were detected; the characteristics of drug release in vitro were investigated; the effects of CHE and CHE-NPs on survival rate of mice B16 melanoma cells were compared， and median inhibition concentrations （IC50） of them were calculated. RESULTS： The optimal formulation included CHE of 2 mg， mPEG-PLGA of 13 mg/mL， F68 of 1.8%. Average entrapment efficiency rate of CHE-NPs prepared by the optimal formulation was （80.18±1.11）%， average drug loading was （11.36±0.28）%， average OD value was 0.96±0.04 [the relative deviation from predicted value （0.90） of OD was 6.67%]; particle size was （113.1±1.40） nm， and Zeta potential was （-21.6±0.29） mV; polydispersity index was 0.07±0.01 （n=3）;accumulative release rates of CHE control and CHE-NPs were 90.87% and 68.68% within 8 h， and drug release behavior in vitro of the latter was in accordance with Weibull kinetic model. Inhibitory effect of CHE-NPs on B16 melanoma cells was significantly stronger than that of CHE; the 24 h IC50 of CHE-NPs and CHE were 69.35 and 107.36 μg/mL， respectively. CONCLUSIONS： The prepared CHE-NPs show good sustained-effect and high capacity of drug loading， and strengthen the inhibitory effect of CHE on melanoma.

KEYWORDS Chelerythrine; Melanoma; Anti-tumor effect; Methoxy polyethylene glycolpolylactic acid-hydroxyacetic acid copolymer; Nanoparticles; Box-Behnken response surface design

基金項(xiàng)目：國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心組建項(xiàng)目（No.2014FU-125Q09）;貴州省科技廳學(xué)術(shù)新苗培養(yǎng)及創(chuàng)新探索專項(xiàng)項(xiàng)目（No.黔科合平臺(tái)人才〔2018〕5766號(hào)-13）;地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州醫(yī)科大學(xué)）開(kāi)放課題基金資助項(xiàng)目（No.黔教合KY字〔2019〕047）

碩士研究生。研究方向：中藥及民族藥物新制劑與新劑型。E-mail：1510428733@qq.com

通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師，碩士。研究方向：中藥及民族藥物新制劑與新劑型。E-mail：1259803072@qq.com

白屈菜紅堿（chelerythrine，CHE）是來(lái)源于苗藥號(hào)筒桿Macleaya cordata（Willd.）R. Br.、白屈菜Chelidonium majus Linn.等藥用植物的生物堿類活性成分。大量研究數(shù)據(jù)顯示，CHE具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，包括人結(jié)腸癌HCT-116、人肝癌HepG2、小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞等[1-4]。但CHE的水溶性差，加之游離藥物本就難以在腫瘤部位擴(kuò)散、滲透，從而導(dǎo)致該成分的開(kāi)發(fā)利用受到限制[5-6]。本研究擬結(jié)合現(xiàn)代藥劑學(xué)新理論與新技術(shù)，將難溶性CHE載于高分子載體中以制備納米粒，以期提高其生物利用度、增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

納米遞藥系統(tǒng)在腫瘤組織中表現(xiàn)出較好的滲透性和滯留效應(yīng)，在構(gòu)建該系統(tǒng)時(shí)，選擇合適的納米載體可改善藥物的遞送和釋放性能[7]。將親水性的甲氧基聚乙二醇（methoxy polyethylene glycol，mPEG）嵌段引入聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]分子鏈中，制成mPEG-PLGA聚合物，該聚合物具有疏水和親水的雙重特性，同時(shí)mPEG可以保護(hù)納米粒不受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的影響，使納米粒在體內(nèi)循環(huán)中擁有較長(zhǎng)的半衰期[8-11];PLGA的存在也可使所載藥物不被快速降解[12-14]。本研究選擇兩親性mPEG-PLGA聚合物作為載體材料，制備CHE納米粒（CHE-NPs）并優(yōu)化其處方，考察所制CHE-NPs的粒徑、Zeta電位等參數(shù)以及體外釋藥行為，評(píng)價(jià)CHE-NPs對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的體外抑制作用，以期構(gòu)建一種對(duì)黑色素瘤抑制活性更強(qiáng)的納米載藥制劑。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Agilent公司），SK8200H型超聲波清洗機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），3310-DMP型激光粒度分析儀（美國(guó)Beckman公司），RCT basic型磁力攪拌器（德國(guó)Ika公司），H2050R型臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司），N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司），JEM-1400FLASh型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司），AUW12D型電子分析天平（日本Shimadzu公司），T09-1S型酶標(biāo)儀、3111型CO2培養(yǎng)箱、Sorvall ST 8R型低溫離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]，CKX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

CHE對(duì)照品（批號(hào)AF9030102，純度≥98%）購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;CHE原料藥（批號(hào)34316-15-9，純度>98%）購(gòu)自西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司;mPEG-PLGA聚合物[mPEG分子量2 000 Da，PLGA分子量15 000 Da，乳酸（LA）/乙醇酸（GA）比例50 ∶ 50]購(gòu)自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司;聚山梨酯80（批號(hào)301C054）、MD34透析袋（截留分子量3 500 Da）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)20210531）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2，批號(hào)20201217）、MTT試劑（批號(hào)309E059）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)1121E0325）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;泊洛沙姆188（F68，批號(hào)T24J10Z80481）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;胎牛血清（批號(hào)20200328）、青-鏈霉素雙抗（批號(hào)20200703）均購(gòu)自賽澳美細(xì)胞技術(shù)（北京）有限公司;含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶（批號(hào)2277237）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 細(xì)胞

小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞（貨號(hào)ZQ0186）購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 CHE-NPs及空白NPs的制備

采用納米沉淀法制備CHE-NPs[15]。精密稱取處方量的mPEG-PLGA聚合物和CHE原料藥分散于丙酮1 mL中，超聲（功率500 W，頻率53 kHz，下同）處理5 min，作為有機(jī)相。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的F68溶液，取5 mL，作為水相。在1 000 r/min條件下，以1 mL/min的速度將有機(jī)相緩慢滴加到水相中，室溫?cái)嚢?0 min，得到淡藍(lán)色乳光的混懸液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，即得CHE-NPs。按上述方法制備不含CHE的空白NPs。CHE-NPs的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

2.2 CHE的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 以Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0 min，20%A;20 min，60%A;25 min，95%A;35 min，20%A）;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定CHE對(duì)照品5 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇超聲10 min，使其溶解，再加入甲醇稀釋、定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密量取CHE-NPs 0.1 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇1.9 mL，超聲30 min破乳，在35 ℃條件下以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)蛹状? mL復(fù)溶，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察 參考文獻(xiàn)[16-17]方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，溶劑（甲醇）、載體材料對(duì)CHE-NPs中CHE的檢測(cè)無(wú)干擾（圖2）;以CHE質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=14.868x-0.813 3（R 2=0.999 8），CHE檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.125～200 μg/mL;精密度試驗(yàn)的RSD為0.22%（n=6）;平均回收率為100.99%（RSD=2.32%，n=6）;穩(wěn)定性（12 h）試驗(yàn)的RSD為1.46%（n=6）;重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為1.21%（n=6）。

2.3 包封率與載藥量的測(cè)定

2.3.1 透析袋的預(yù)處理 取透析袋，剪成適宜長(zhǎng)度，放入水中煮沸10～20 min，冷卻后取出，浸泡在水中，備用。

2.3.2 透析平衡時(shí)間的確定 精密吸取CHE-NPs 2 mL，置于透析袋內(nèi)，兩頭扎緊。將封口的透析袋置于錐形瓶中，以水50 mL為透析介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為600 r/min，分別于透析0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h時(shí)精密吸取外液0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)足等體積水[18]。用甲醇將外液稀釋至1 mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算外液中CHE的質(zhì)量濃度，同時(shí)繪制濃度-平衡時(shí)間曲線（圖3）。由圖3可知，隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)，CHE的質(zhì)量濃度呈先升高后降低再升高再降低的趨勢(shì)，說(shuō)明CHE-NPs已逐漸破裂;當(dāng)透析時(shí)間為1.5 h時(shí)，外液中CHE的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值。因此，本研究選擇1.5 h為透析平衡時(shí)間。

2.3.3 包封率與載藥量的測(cè)定方法 精密吸取CHE- NPs 2 mL，置于透析袋內(nèi)，兩頭扎緊。將封口的透析袋置于錐形瓶中，以水50 mL為透析介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為600 r/min，于透析1.5 h時(shí)精密吸取外液0.5 mL，用甲醇稀釋至1 mL，再用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算外液中CHE的質(zhì)量濃度。按以下公式計(jì)算包封率和載藥量：包封率（%）=（藥物總量-外液中藥物含量）/藥物總量×100%，載藥量（%）=（藥物總量-外液中藥物含量）/（藥物總量+輔料總量）×100%。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化CHE-NPs的處方

本課題組前期以有機(jī)溶劑種類、有機(jī)相與水相比例、F68濃度、磁力攪拌器轉(zhuǎn)速、載體材料質(zhì)量濃度、投藥量、載體材料種類為影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)CHE-NPs包封率、載藥量的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究選擇對(duì)包封率和載藥量影響較大的因素——CHE投藥量（A）、mPEG-PLGA質(zhì)量濃度（B）、F68濃度（C）為自變量，以包封率（Y1）和載藥量（Y2）的總評(píng)歸一（OD）值為因變量，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以Design Expert 12軟件優(yōu)化CHE-NPs處方。由于Y1、Y2的取值越大越好，故選擇對(duì)應(yīng)dmax[dmax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）]以計(jì)算OD值：OD=（d1×d2）[19-20]。CHE-NPs處方優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design Expert 12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到二次多元回歸方程為OD=0.597 0+0.242 0×A-0.230 5×B+0.057 0×C+0.071 5×AC+0.075 5×BC-0.001 3×A2-0.128 8×B2-0.034 2×C2（R 2=0.942 3），方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型的擬合程度較好（P=0.001 5），因素A、B、B2對(duì)OD值均具有顯著影響（P<0.05）。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)A與B、B與C、A與C交互作用對(duì)OD值的影響，本研究采用Design Expert 12軟件繪制各因素的響應(yīng)面圖和等高線圖，詳見(jiàn)圖4。由圖4可知，OD值隨A、C的升高而升高。根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果，求解二次多元方程得到CHE-NPs的最優(yōu)處方如下：CHE 2.0 mg、mPEG-PLGA質(zhì)量濃度12.79 mg/mL、F68濃度1.8%，為方便稱量，優(yōu)化mPEG-PLGA質(zhì)量濃度為13 mg/mL。

按上述最優(yōu)處方稱取CHE、mPEG-PLGA聚合物，分散于丙酮1 mL中，超聲處理5 min，作為有機(jī)相。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%的F68溶液5 mL，作為水相。在1 200 r/min條件下，以1 mL/min的速度將有機(jī)相緩慢滴加到水相中，室溫?cái)嚢?0 min，得到淡藍(lán)色乳光的混懸液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，即得CHE-NPs。平行制備3份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)得平均包封率為（80.18±1.11）%，平均載藥量為（11.36±0.28）%，平均OD值為0.96±0.04[與OD預(yù)測(cè)值（0.90）的相對(duì)偏差為6.67%]，說(shuō)明Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)所得的模型預(yù)測(cè)良好。

2.5 CHE-NPs的表征

2.5.1 粒徑與Zeta電位 吸取按最優(yōu)處方制備的CHE-NPs 0.2 mL，加水1.8 mL稀釋，使其均勻分散，所得混懸液呈淡藍(lán)色乳光。取上述混懸液適量，采用激光粒度分析儀，在25 ℃下測(cè)定CHE-NPs的粒徑和Zeta電位，重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果顯示，CHE-NPs的粒徑為（113.1±1.40）nm，Zeta電位為（-21.6±0.29）mV，多分散性指數(shù)為0.07±0.01（n=3）。CHE-NPs的粒徑分布圖見(jiàn)圖5。

2.5.2 形態(tài)觀察 吸取按最優(yōu)處方制備的CHE-NPs 1 mL，加水稀釋10倍，用2%磷鎢酸于室溫下染色1～2 min，于透射電子顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察。結(jié)果顯示，所得CHE-NPs呈球形，表面光滑、圓整，大小均勻，分散良好。結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.6 體外穩(wěn)定性考察

將按最優(yōu)處方制備的CHE-NPs置于4 ℃冰箱中冷藏，分別于冷藏0、7、14 d時(shí)取樣，按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定粒徑、Zeta電位及多分散性指數(shù)。結(jié)果顯示，CHE-NPs的粒徑、Zeta電位及多分散性指數(shù)均無(wú)明顯變化，其混懸液仍呈淡藍(lán)色乳光，說(shuō)明CHE-NPs的穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.7 體外釋藥實(shí)驗(yàn)

采用動(dòng)態(tài)透析法進(jìn)行考察。精密量取CHE對(duì)照品溶液、按最優(yōu)處方制備的CHE-NPs各5 mL，分別置于預(yù)處理后的透析袋中，兩頭扎緊，置于生理鹽水（含0.3%聚山梨酯80，下同）20 mL中，于（37.0±0.5）℃條件下以100 r/min恒溫振蕩，分別于孵育1、2、4、6、8、12、24、48 h時(shí)取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)足等溫等體積的生理鹽水。樣品于60 ℃水浴中揮干，殘?jiān)蛹状? mL復(fù)溶，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中CHE的質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)平行操作3次，按以下公式計(jì)算累積釋放率：累積釋放率=（V0cn+V[∑][n=1][t-1]ct）/M藥（式中，V0表示釋放介質(zhì)總體積，t表示n-1，cn表示第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的CHE質(zhì)量濃度，V表示每次取樣的體積，ct表示n-1個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)得的CHE質(zhì)量濃度，M藥表示投入藥物總質(zhì)量）。采用Origin 2021軟件，以累積釋放率（Q）和釋放時(shí)間（t）對(duì)CHE-NPs的體外釋藥行為進(jìn)行零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi動(dòng)力學(xué)模型、Weibull動(dòng)力學(xué)模型方程擬合。結(jié)果顯示，CHE對(duì)照品溶液在孵育8 h時(shí)的累積釋放率已達(dá)90.87%，提示已基本釋放完全，而CHE-NPs 在孵育8 h時(shí)的累積釋放率為68.68%，48 h時(shí)的累積釋放率為88.72%，具有緩釋特征，其體外釋藥行為符合Weibull動(dòng)力學(xué)模型。CHE對(duì)照品和CHE-NPs的體外釋放曲線見(jiàn)圖7，CHE-NPs的體外釋藥動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果見(jiàn)表5。

2.8 體外抑瘤作用評(píng)價(jià)

2.8.1 空白NPs的細(xì)胞毒性 采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16黑色素瘤細(xì)胞，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h至細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置9個(gè)組別，分別為空白組（無(wú)細(xì)胞、無(wú)藥物）、對(duì)照組（有細(xì)胞、無(wú)藥物）和不同質(zhì)量濃度（10、25、50、100、250、500、1 000 μg/mL[21]，以mPEG-PLGA計(jì)）空白NPs，藥物溶液用空白培養(yǎng)基配制。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物干預(yù)24 h后，每孔加入MTT試劑10 μL（1×PBS配制，5 mg/mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。棄去孔中液體，每孔加入DMSO 150 μL，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A），并按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。結(jié)果顯示，空白NPs對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的存活率無(wú)明顯影響，說(shuō)明其具有良好的生物相容性。結(jié)果見(jiàn)圖8。

2.8.2 CHE-NPs的細(xì)胞毒性 按“2.8.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度CHE原料藥（1、20、40、60、80、100、120 μg/mL，濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）和不同質(zhì)量濃度CHE-NPs（1、20、40、60、80、100、120 μg/mL，以CHE計(jì)，濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）干預(yù)24、48、72 h對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞存活率的影響，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果顯示，當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)20 μg/mL后，CHE-NPs的細(xì)胞毒性均顯著大于CHE原料藥（P<0.05或P<0.01），且有濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)，CHE-NPs和CHE原料藥的24 h半數(shù)抑制濃度分別為69.35、107.36 μg/mL。結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

mPEG-PLGA聚合物易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水，在水相比例高的流動(dòng)相條件下易對(duì)HPLC儀及色譜柱造成不良影響（4 min時(shí)有最大吸收）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用氮?dú)饬鞔蹈蓸悠愤M(jìn)行前處理，可減少mPEG-PLGA聚合物對(duì)色譜系統(tǒng)的干擾。

本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)考察中對(duì)mPEG-PLGA聚合物進(jìn)行了篩選，分別考察了親水段和疏水段比例對(duì)CHE-NPs包封率、載藥量的影響。因CHE是由疏水段PLGA包裹，所以較大的疏水段分子量對(duì)CHE-NPs包封率和載藥量的影響更大。當(dāng)mPEG分子量為2 000 Da、PLGA分子量為15 000 Da時(shí)，CHE-NPs的包封率與載藥量均較高。

為準(zhǔn)確地測(cè)定CHE-NPs的包封率，本課題組前期考察了低速離心法、低溫超速離心法、魚(yú)精蛋白沉淀法和透析袋法對(duì)CHE-NPs包封率測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是低速還是超速離心都無(wú)法將NPs與游離的CHE完全分離。使用魚(yú)精蛋白沉淀吸附之后再離心，可能會(huì)使NPs和游離CHE的分離度更高，因?yàn)轸~(yú)精蛋白是一種堿性氨基酸，擁有大量帶正電的胍基，可與Zeta電位為負(fù)的NPs相結(jié)合，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行超速離心，可使包載的NPs凝聚沉淀[22-25]。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚(yú)精蛋白沉淀法所測(cè)得的包封率重復(fù)性及穩(wěn)定性并不佳，相對(duì)偏差為25.44%。而透析袋法所測(cè)得的包封率穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，故本研究最終選擇透析袋法測(cè)定CHE-NPs的包封率。

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)是一種多因素非線性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，可以連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)因素及水平進(jìn)行分析，既彌補(bǔ)了正交試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)的不足，又具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精準(zhǔn)度高的優(yōu)點(diǎn)，在制劑優(yōu)化應(yīng)用領(lǐng)域顯現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[26-27]。本研究選擇Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)CHE-NPs的處方進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，該法所擬合的模型回歸方程預(yù)測(cè)性良好;模型擬合的R 2為0.942 3，表明94.23%實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異可用此回歸模型來(lái)解釋。體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHE-NPs體外釋藥行為符合Weibull動(dòng)力學(xué)模型，且具有緩釋特征。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHE-NPs對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞有明顯的體外抑制作用，在相同用量下，其抑制作用強(qiáng)于CHE原料藥，且有一定的時(shí)間和濃度依賴趨勢(shì)。這可能與納米遞藥系統(tǒng)本身的優(yōu)勢(shì)相關(guān)，如較小的粒徑、在腫瘤部位的高度滯留及更易被細(xì)胞內(nèi)吞攝取等[28-29]。

綜上所述，本研究采用納米沉淀法成功制備了一種以mPEG-PLGA聚合物為載體的CHE-NPs，其具有緩釋作用和較強(qiáng)的載藥能力，同時(shí)增強(qiáng)了CHE對(duì)黑色素瘤的體外抑制作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組將繼續(xù)探索CHE-NPs在體內(nèi)的抑瘤作用，考察其是否能有效抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)及其抑瘤作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-09-08 修回日期：2021-11-18）