吳晶晶 張文娟 張駿鴻 張雅婷 黎莉 盧月 危建安 韓凌

中圖分類號 R735.7;R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）24-2963-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.24.04

摘 要 目的：探討澳洲茄邊堿對人肝癌HepG2細胞生長和凋亡的影響，并研究其潛在作用機制。方法：考察0（空白組）～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h對HepG2細胞存活率的影響，0（空白組）、6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d對細胞克隆形成的影響，0（空白組）、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h對細胞凋亡率和細胞中B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）mRNA表達量以及Bcl-2、剪切的caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白表達量和磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）/AMPKα的影響。考察AMPK抑制劑compound C對經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后細胞中AMPKα、Bcl-2蛋白表達量的影響。結(jié)果：與空白組比較，1～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h均可顯著降低細胞存活率（P<0.05），且有濃度依賴趨勢，其半數(shù)抑制濃度分別為8.310、7.996 μmol/L;經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d后細胞的克隆形成率顯著降低（P<0.05）。6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用后細胞凋亡率和細胞中Bax、caspase-3 mRNA及cleaved caspase-3蛋白（除8 μmol/L外）表達量、p-AMPKα/AMPKα（除8 μmol/L外）均顯著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA及蛋白表達量均顯著降低（P<0.05），部分指標變化有濃度依賴性。compound C可以抑制AMPKα蛋白表達并逆轉(zhuǎn)澳洲茄邊堿對Bcl-2蛋白的抑制作用。結(jié)論：澳洲茄邊堿可以抑制HepG2細胞增殖，誘導其凋亡，作用機制可能與激活AMPK信號通路有關。

關鍵詞 澳洲茄邊堿;人肝癌HepG2細胞;生長;凋亡;磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶信號通路

Preliminary Study on Effects of Solamargine on the Growth and Apoptosis of Human Hepatocarcinoma Cells HepG2 and Its Mechanism

WU Jingjing1，ZHANG Wenjuan2，ZHANG Junhong1，ZHANG Yating2，LI Li1，LU Yue1，WEI Jian’an1，HAN Ling3，4（1. Research Team of Molecular Biology and System Biology of Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120， China; 2. The Second Clinical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510120， China; 3. State Key Laboratory of Dampness Syndrome of Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120， China; 4. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome/Guangdong Clinical Research Center for Dermatosis in Chinese Medicine/Guangdong-Hong Kong-Macau Joint Lab for Chinese Medicine and Immune Disease Research， Guangzhou 510120， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To explore the effects of solamargine on the growth and apoptosis of human hepatocarcinoma cells HepG2 and its underlying mechanism. METHODS： The effects of 0（blank group）-12 μmol/L solamargine treatment of 24， 48 h on survival rate of HepG2 cells were investigated. The effects of 0 （blank group）， 6 μmol/L solamargine treatment of 10 days on cell clone formation were also investigated. The effects of 0 （blank group）， 4， 6， 8 μmol/L solamargine for 24 h on the apoptotic rate of cells， mRNA expression of Bcl-2， Bax and caspase-3， protein expression of Bcl-2 and cleaved caspase-3 as well as ratio of p-AMPKα to AMPKα were all tested. The effects of AMPK inhibitor as compound C on the protein expression of AMPKα and Bcl-2 in cells were investigated after treated with 6 μmol/L solamargine for 24 h. RESULTS： Compared with blank group， 1-12 μmol/L solamargine for 24， 48 h could significantly decrease the survival rates of cells （P<0.05） in a concentration-dependent manner; IC50 of them were 8.310 and 7.996 μmol/L，respectively; the rate of cell clone formation was decreased significantly after treated with 6 μmol/L solamargine? for 10 days （P<0.05）. The apoptotic rate of HepG2 cells， mRNA expression of Bax and caspase-3， protein expression of? cleaved caspase-3 （except for 8 μmol/L） as well as ratio of p-AMPKα to AMPKα （except for 8 μmol/L） were all increased significantly after treated with 6， 8 μmol/L solamargine （P<0.05）; mRNA and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly （P<0.05）; the changes of some indexes were in a concentration-dependent manner. The compound C could inhibit protein expression of AMPKα， and reverse the inhibitory effect of solamargine on Bcl-2 protein. CONCLUSIONS： Solamargine can inhibit the proliferation of HepG2 cells and induce apoptosis， the mechanism of which may be associated with activating AMPK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Solamargine; Human hepatocarcinoma cells HepG2; Growth; Apoptosis; AMPK signaling pathway

基金項目：國家自然科學基金（青年科學基金）資助項目（No.81902752）;廣東省科技計劃項目（No.2020B1212030006）;廣東省自然科學基金項目（No.2020A1515010607）;省部共建中醫(yī)濕證國家重點實驗室重點項目（No.SZ2021ZZ29）;廣東省中醫(yī)院-瑞博奧研究項目（No.YN2018RBA02）

助理研究員，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎。電話：020-39318678。E-mail：wujingjing6028@gzucm.edu.cn

通信作者：研究員，博士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎。電話：020-39318678。E-mail：linghan99@gzucm.edu.cn

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是惡性腫瘤導致患者死亡的第三大原因[1]。目前，手術切除是肝細胞癌的最佳治療方法，特別是在發(fā)病早期且腫塊直徑小于2 cm時，手術切除是最有效的方法，但患者的5年復發(fā)率仍高達68%[2-3]。近年來，化療和靶向治療在肝癌的治療中得到了廣泛的應用，其代表藥物索拉非尼和侖伐替尼可以明顯提高無法進行手術的肝癌患者的生存率[4-5]。然而，分子靶向治療的耐受性和相對嚴重的副作用限制了這類藥物在臨床上的進一步應用[6]。因此，尋找新的肝癌治療方法和抗肝癌藥物意義重大。

澳洲茄邊堿（solamargine）是中藥龍葵Solanum nigrum L.生物堿中的主要成分，屬于甾體生物堿的膽甾烷衍生物，已被證實對非小細胞肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用[7-10]。但該成分抑制肝癌細胞生長的分子機制尚不明確。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是維持細胞能量穩(wěn)態(tài)的重要介質(zhì)，活化后的AMPK可以通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路來促進細胞凋亡[11]?；诖?，本研究擬探討澳洲茄邊堿對人肝癌HepG2細胞生長和凋亡的影響，以及可能涉及的分子機制，為該成分在肝癌臨床治療領域中的應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SYNERGY-H1型多功能酶標儀（美國BioTek公司），TS2型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司），Centrifuge 5430R型高速離心機、Galaxy 170S型CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司），Novo Quanteon型流式細胞儀（美國ACEA Biosciences公司），ViiA 7型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司），Mini-PROTEAN? Tetra cell小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDoc Touch型高靈敏度化學發(fā)光成像儀（美國Bio-Rad公司），NanoDrop 2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），ELPH 1301S型相機（日本Canon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

澳洲茄邊堿對照品（批號MUST-20112005，純度≥98%）購自成都曼斯特生物科技有限公司;二甲基亞砜（DMSO，批號RNBH8343）購自美國Sigma公司;MTT試劑（批號S3444）購自美國MP Biomedicals公司;4%多聚甲醛固定液、結(jié)晶紫染色液均購自上海碧云天生物技術有限公司;兔源磷酸化AMPKα（p-AMPKα）（T172）單克隆抗體、兔源AMPKα單克隆抗體、兔源B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）單克隆抗體、兔源胱天蛋白酶3（caspase-3）單克隆抗體、兔源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、兔源剪切的caspase-3（cleaved caspase-3）單克隆抗體和RIPA細胞裂解液（批號分別為50081S、5832S、4223S、9665S、4970S、9664S、7723S）均購自美國CST公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（批號1706515）購自美國Bio-Rad公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（批號73001255）購自杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素溶液和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液均購自美國Gibco公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號VK314219）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國Millipore公司;Trizol試劑（批號74117）購自美國Life Invitrogen公司;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預混型試劑盒、SYBR? Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批號分別為AG11728、AG11718）均購自艾科瑞生物科技有限公司;AMPK抑制劑6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶對照品（compound C，批號HY-13418A，純度99.65%）購自美國MCE公司;ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒（批號36208ES76）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 細胞

本研究所用人肝癌HepG2細胞購自廣州賽庫生物科技有限公司。

2 方法

2.1 澳洲茄邊堿溶液的制備

取澳洲茄邊堿對照品適量，用DMSO溶解、稀釋，制成濃度為50 mmol/L的貯備液，分裝后，于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞用含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（下文簡稱“DMEM完全培養(yǎng)基”），在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每隔24 h換液1次，待細胞生長至70%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化（消化方法下同）傳代，待細胞貼壁后，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 細胞存活率的檢測和澳洲茄邊堿作用濃度及時間的篩選

采用MTT法檢測細胞存活率。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，消化后計數(shù)，分別以每孔10 000個接種到96孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、1、2、4、6、8、10、12 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，每個濃度設置3個復孔。分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT試劑10 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩5 min，使用酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的吸光度（A），按下式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=實驗組A值/空白組A值×100%。實驗重復3次，取平均值。使用GraphPad Prism 7軟件計算半數(shù)抑制濃度，以篩選后續(xù)實驗的藥物作用濃度和作用時間。

2.4 分組與給藥

取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以每孔2×105個接種到6孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、4、6、8 μmol/L（濃度根據(jù)“2.3”項下結(jié)果設置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，每個濃度設置3個復孔。

2.5 細胞凋亡率的檢測

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法結(jié)合流式細胞儀進行檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，消化并收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）離心（100×g，5 min）洗滌2次，棄去上清液;用水稀釋5×binding buffer得1×binding buffer，取1×binding buffer 500 μL重懸細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC試劑5 μL和PI試劑10 μL，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況，記錄細胞凋亡率（含早期凋亡率和晚期凋亡率）。實驗重復3次。

2.6 細胞克隆形成率的檢測

采用結(jié)晶紫染色法進行檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，以每孔500個接種到6孔板中，每孔加入DMEM完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)次日，棄去培養(yǎng)基，分別加入含澳洲茄邊堿0（空白組）、6 μmol/L（濃度根據(jù)“2.5”項下結(jié)果設置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，每個濃度設置3個復孔。培養(yǎng)10 d后，用4%多聚甲醛固定液固定30 min，以結(jié)晶紫染色液染色30 min，再用ddH2O沖洗干凈，記錄各孔內(nèi)形成的克隆數(shù)[細胞數(shù)大于50個的集落（直徑大于0.3～1.0 mm）計為1個克隆]并拍照，按下式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

2.7 細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌2次，每孔加入Trizol試劑1 mL，提取細胞總RNA，使用超微量分光光度計測定RNA濃度后，按試劑盒說明書方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述cDNA為模板，按試劑盒說明書方法進行擴增。反應體系（共10 μL）如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix（ROX plus）5 μL，cDNA模板 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，RNase-free水3.6 μL。反應程序采用兩步法，具體條件如下：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸30 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參計算細胞中Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、caspase-3 mRNA的表達量。PCR引物均委托美國Thermo Fisher Scientific公司設計、合成，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.8 細胞中p-AMPKα、AMPKα、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種、分組、給藥。培養(yǎng)24 h后，收集細胞，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，煮沸5 min使其變性。取變性蛋白30 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST緩沖液（含0.5%吐溫20，下同）洗滌3次后，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;加入p-AMPKα（T172）（稀釋比例1 ∶ 1 000）、AMPKα（稀釋比例1 ∶ 1 000）、Bcl-2（稀釋比例1 ∶ 1 000）、caspase-3（稀釋比例1 ∶ 1 000）、cleaved caspase-3（稀釋比例1 ∶ 1 000）、β-actin（稀釋比例1 ∶ 5 000）一抗，4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液洗滌3次，加入相應二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000），室溫孵育1 h;用TBST緩沖液洗滌3次，將顯色液A液和B液混合，用移液槍均勻加至膜上，再用高靈敏度化學發(fā)光成像儀成像，用Image Lab 5.2.1軟件分析目標蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值，并計算p-AMPKα/AMPKα，再將上述結(jié)果與空白組比較進行歸一化處理，作為目標蛋白的表達量。

另取對數(shù)生長期的HepG2細胞，按“2.4”項下方法接種后分為空白對照組、澳洲茄邊堿組、compound C組和compound C+澳洲茄邊堿組，每組設置3個復孔。相應藥物組加入含compound C 5 μmol/L[12]的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)基，再（或）加入含澳洲茄邊堿6 μmol/L（濃度根據(jù)“2.5”項下結(jié)果設置）的DMEM完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后按上述方法測定細胞中AMPKα、Bcl-2蛋白的表達量。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。實驗結(jié)果采用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 澳洲茄邊堿對HepG2細胞存活率的影響

與空白組比較，1～12 μmol/L澳洲茄邊堿作用24、48 h后，HepG2細胞存活率均顯著降低（P<0.05），且有濃度依賴趨勢。澳洲茄邊堿作用24、48 h對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度分別為8.310、7.996 μmol/L，故后續(xù)實驗以4、6、8 μmol/L作為澳洲茄邊堿的作用濃度，24 h作為其作用時間。澳洲茄邊堿作用24、48 h對HepG2細胞存活率的影響見表2。

3.2 澳洲茄邊堿對HepG2細胞凋亡率的影響

0、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細胞的凋亡率分別為（8.687±0.331）%、（9.707±0.891）%、（12.753±0.534）%、（13.900±1.015）%，其中6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用后HepG2細胞的凋亡率均顯著高于空白組和4 μmol/L澳洲茄邊堿（P<0.05），故后續(xù)細胞克隆形成實驗和機制驗證實驗以6 μmol/L作為澳洲茄邊堿的作用濃度。澳洲茄邊堿對HepG2細胞凋亡率的影響見圖1。

3.3 澳洲茄邊堿對HepG2細胞克隆形成的影響

經(jīng)6 μmol/L澳洲茄邊堿作用10 d后，HepG2細胞的克隆形成率較空白組顯著降低[（20.666±5.033）%vs.（32.667±3.055）%，P<0.05]。澳洲茄邊堿對HepG2細胞克隆形成的影響見圖2。

3.4 澳洲茄邊堿對HepG2細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達的影響

與空白組比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細胞中Bcl-2 mRNA的表達量均顯著降低（P<0.05），Bax、caspase-3 mRNA的表達量均顯著升高（P<0.05）。與4 μmol/L澳洲茄邊堿比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細胞中caspase-3 mRNA的表達量均顯著升高（P<0.05）。澳洲茄邊堿對HepG2細胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表達的影響見表3。

3.5 澳洲茄邊堿對HepG2細胞中Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達的影響

與空白組比較，6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細胞中Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低（P<0.05），6μmol/L澳洲茄邊堿作用后HepG2細胞中cleaved caspase-3蛋白的表達量顯著升高（P<0.05）。與4、6 μmol/L澳洲茄邊堿比較，8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細胞中Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低（P<0.05）。澳洲茄邊堿對HepG2細胞中Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表達的影響見圖3、表4。

3.6 澳洲茄邊堿對AMPK信號通路的影響及驗證

經(jīng)0、4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后，HepG2細胞中p-AMPKα/AMPKα分別為1、1.212±0.114、1.315±0.143、1.310±0.320。與空白組比較，4、6、8 μmol/L澳洲茄邊堿作用24 h后HepG2細胞中p-AMPKα/AMPKα均有升高趨勢，其中6 μmol/L澳洲茄邊堿可使上述比值顯著升高（P<0.05）。澳洲茄邊堿對HepG2細胞中p-AMPKα、AMPKα蛋白表達影響的電泳圖見圖4。

與空白對照組比較，compound C組、compound C+澳洲茄邊堿組HepG2細胞中AMPKα蛋白的表達量和澳洲茄邊堿組HepG2細胞中Bcl-2蛋白的表達量均顯著降低（P<0.05）。與澳洲茄邊堿組比較，compound C+澳洲茄邊堿組HepG2細胞中Bcl-2蛋白的表達量顯著升高（P<0.05）。AMPK抑制劑對經(jīng)澳洲茄邊堿作用后HepG2細胞中AMPKα、Bcl-2蛋白表達的影響見圖5、表5。

4 討論

我國肝癌的發(fā)病人數(shù)占全世界所有肝癌病例總數(shù)的55%[13-14]。盡管治療肝癌有許多策略，包括手術切除、肝臟移植、消融、經(jīng)動脈化學栓塞術和分子靶向治療（索拉非尼和侖伐替尼）等，但療效仍不令人滿意[15-16]。因此，進一步尋找新的抗肝癌治療途徑和藥物是國內(nèi)外研究的熱點之一。

已有體內(nèi)外研究表明，澳洲茄邊堿對鼻咽癌、肺癌細胞的生長均有抑制作用[8-9]，但其在肝癌細胞中的作用尚不明確。細胞增殖是活細胞的重要生理功能之一，當細胞受到致癌因素的影響時，其無法正常地完成分化，取而代之的則是不受控制地持續(xù)分裂、惡性增殖[17-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茄邊堿可通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達來抑制細胞的遷移和侵襲[20]。本研究采用MTT法和細胞克隆形成實驗考察了澳洲茄邊堿對HepG2細胞生長的影響，結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可降低HepG2細胞的存活率且對存活率的影響有濃度依賴趨勢，并能抑制其克隆形成。

細胞凋亡是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的一種基本的生物學過程[21]。Bcl-2和Bax均為Bcl-2家族成員，是參與細胞凋亡的重要因子。Bcl-2在維持細胞存活中起著重要作用，而Bax的主要作用是加速細胞凋亡[22]。有研究表明，細胞凋亡實際上是caspase被活化并誘發(fā)凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的過程[23]。caspase-3是caspase家族成員之一，可激活凋亡信號的傳遞，是促進細胞凋亡的關鍵蛋白;caspase-3切割之后可形成cleaved caspase-3，cleaved caspase-3是caspase-3的活化形式并能夠破壞細胞功能、促進細胞凋亡[23-24]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿可通過抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達，促進Bax、caspase-3 mRNA和cleaved caspase-3蛋白的表達來誘導HepG2細胞凋亡，與Ding等[25]研究結(jié)果一致。

AMPK是細胞能量的傳感器，可調(diào)節(jié)細胞的增殖、生長和自噬[26]。有研究表明，AMPK可作為抑癌因子發(fā)揮作用，其活化可以抑制腫瘤細胞的增殖[27]。AMPK還是一種參與凋亡信號通路信號轉(zhuǎn)導的交互蛋白，包括LKB1（liver kinase B1）/AMPK和AMPK/p53信號通路[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)，ω-羥基十一碳-9-烯酸可增加乳腺癌細胞中AMPK的磷酸化水平和cleaved caspase-3、Bax蛋白的表達水平，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達水平，而使用AMPK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這種作用[30]。本研究結(jié)果顯示，澳洲茄邊堿作用于HepG2細胞后可輕微上調(diào)磷酸化AMPKα蛋白的表達，使用AMPK抑制劑compound C后可以抑制AMPKα蛋白的表達，從而逆轉(zhuǎn)澳洲茄邊堿對Bcl-2蛋白的抑制作用，說明澳洲茄邊堿誘導HepG2細胞凋亡的作用可能與調(diào)控AMPK信號通路有關。

綜上所述，澳洲茄邊堿可以抑制HepG2細胞增殖，誘導其凋亡，作用機制可能與激活AMPK信號通路有關。在下一步研究中，本課題組將采用肝癌細胞荷瘤小鼠模型評估澳洲茄邊堿治療肝癌的效果與機制。

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（收稿日期：2021-08-19 修回日期：2021-11-19）